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  liuwei4150 2011-10-11 00:00:00

  不會~~~

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  mdaocax4206 2011-10-11 00:00:00

  這分為可溶蛋白和包涵體兩種，具體方法請看鏈接。如果你用的介質(zhì)不是Ni-NTA，請看你的說明書。

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  郭老大66 2017-09-05 10:33:30

  見http://zhidao.baidu.com/question/292063616.html或 鎳柱分離純化 固定金屬離子親和柱主要用于金屬螯化離子。位于許多蛋白中的組氨酸殘基將會和許多金屬離子，例如鋅。銅，鎳，鐵等形成復合物。因此，該柱料能選擇性螯合一些具有組氨酸殘基的蛋白質(zhì)。但是半胱氨酸和咯氨酸殘基也能和固定化金屬螯和。但是親和力比組氨酸要弱。所以，結合的強度是和緩沖液的PH和金屬離子決定的。 金屬螯和柱料主要是由亞氨基的乙酰乙酸成分耦聯(lián)瓊脂糖柱料，借助醚長生7個原子的空間。 全部容量：24-30um的含有zn的干膠 柱料結構：6%的高鉸鏈的瓊脂糖 柱料大?。?5-165um 平均微粒：90um 直流速度：25度/0.1MPa/30倍柱床/5厘米高度/每小時可達700厘米 Z大壓強：0.3MPa PH變化：長期3-13 短期2-14 化學穩(wěn)定：通用含水緩沖液 0.01M鹽酸，1.0M NAOH， 20%乙醇（保存7天） 物理性質(zhì)：可以忽略在PH或者離子變化下的體積變化 耐熱性能：121度下0.1M乙酸鈉作用半小時 金屬螯和柱料保存于事先填充于20%乙醇。所以要攪拌驅(qū)除20%乙醇溶液。換成去離子水。比例是25%去離子水和75%處理膠。 處理金屬螯和柱料： 1 平衡所有用到的材料于室溫。 2 攪拌金屬螯和柱料 3 倒水進柱子，驅(qū)除氣體。用無離子水液封幾厘米。 4 將金屬螯和柱料連續(xù)倒進柱子，用玻璃棒支撐柱壁防止氣泡形成。 5 然后立即用無離子水液封，裝上柱蓋，連接上泵。 6 打開柱子底部的開關，然后調(diào)節(jié)泵的流速。通常是不超過0.3MPa的。 7 經(jīng)過一個穩(wěn)定的柱床填鴨后，維持填壓速度為3個柱床。 使用adaptor 1 經(jīng)過上溯填鴨后，關閉柱床下面開關，移開上面的薄膜，小心的加上去離子水進行液封。 2 一定角度插入adaptor，確保沒有氣泡。 3 確保所有的連接都沒有問題，柱子/泵/樣品接受器 4 傾斜插入活塞確保沒有氣泡和管道充滿液體。利用活泵正反向的流動確保沒有氣泡。 5 固定adaptor，打開柱子開關，開始緩沖液的流動。先以填鴨的速度直到柱床穩(wěn)定后。 固定金屬離子： 金屬螯和柱料通過水來螯和金屬的，避免發(fā)生沉淀在膠上。 1 確保柱子已經(jīng)平衡好。如果有必要可以洗2個柱床（去離子水） 2 選擇金屬離子和0.1-0.3M中弱性酸。例如鐵離子PH 3左右就好，避免形成沉淀和共沉。 3 加入一倍柱床的金屬離子溶液 4 5倍柱床的去離子水洗滌 5 至少2倍柱床的平衡緩沖液 結合： 發(fā)生于PH5.5-8.5之間.Z強反映發(fā)生于Z后 初始緩沖液的選擇決定于金屬離子和樣品的結合性質(zhì)。乙酸鈉或者磷酸鈉是比較好的緩沖液中不能使用EDTA或者檸檬酸鹽 Z通用緩沖液： 0.01-0.2M磷酸鈉 0.05M乙酸鈉 強烈推薦加入0.15-0.5M NaCl用于防止離子交換。 通常如果不知道一個蛋白的結合能力，Z好的就是使用鋅離子和中性的磷酸或者乙酸鹽，同時含有0.15-0.5M NaCl 去垢劑不會影響蛋白質(zhì)的結合能力 金屬離子的取代意味著蛋白發(fā)生了結合。這種現(xiàn)象可以通過顏色來決定 洗脫蛋白：（3種方法） 1 降低PH(一步或者分步)，大部分蛋白溶解于PH4-6Z終3-4是可容的?？蛇x擇檸檬酸鹽，磷酸或者乙酸鹽。 2 逐步提高咪唑的濃度（0-0.5M），梯度變化Z好是在初始緩沖液的PH范圍。 3 加入EDTA或者EGTA可洗脫蛋白質(zhì)。但是不是通用的。 利用離心或者重力作用純化組氨酸位點蛋白 通過上鎳進行選擇性結合含有組氨酸位點蛋白，然后利用含有咪唑的緩沖液洗脫蛋白。 以下的實驗是為了Z大化將組氨酸位點蛋白結合到金屬螯和柱料，然后確保能夠洗脫下來。當結合和洗脫的條件尚未明了時，這些方法也是很好用的。 為了獲得高純度的蛋白，必須摸索咪唑的緩沖液在樣品上柱和洗脫時的濃度。通常使用10mM-500mM范圍的咪唑的緩沖液進行剃度洗脫，然后通過收集和SDS-PAGE 蛋白電泳確定洗脫濃度。 為了純化不可容的含有his位點的蛋白質(zhì)，（包含體），可以在變性條件下進行。利用8M尿素或者6M鹽酸呱進行溶解蛋白。 樣品處理： 樣品要經(jīng)可能溶解，避免出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象，所以可以利用0.45uM慮膜過濾雜志 如果樣品時溶解于20mM磷酸緩沖液中（含有0.5M Nacl，PH7.4），必須調(diào)整PH到7－8。 上柱前準備： 洗柱料： 1 親柔震動膠瓶充旋膠料 2 利用吸管吸出足量柱料用以純化目的。每毫升柱料可以吸納5毫克蛋白 3 500g 離心2－5分鐘，沉淀柱料。 4 小心去除上清 5 加入5倍體積去離子水，充分振蕩柱料。可以倒置來回5分鐘，不要機械攪拌。 6 再次500g 離心2－5分鐘，沉淀柱料。 7 再次小心去除上清 掛鎳： 1 加入0.5倍柱床體積0.1M硫酸鎳，充分振蕩柱料。可以倒置來回5分鐘，不要機械攪拌。 2 500g 離心2－5分鐘，沉淀柱料。 3 小心去除上清 洗柱： 1加入5倍體積去離子水，充分振蕩柱料，來回倒置5分鐘 2 500g 離心2－5分鐘，沉淀柱料。 3小心去除上清 4 再洗兩次柱料（一共3×5柱床去離子水） 5 Z后用一倍體積起始緩沖液充旋柱料（20mM Na2HPO4 /0.5MnaCl/10mM咪唑/PH7.4） 利用離心來純化： 上樣： 1 在起始緩沖液中加入樣品，然后使整體膠濃度達到50％ 2 親柔攪拌，室溫離心5－30分鐘，結合能力取決于蛋白和樣品濃度。 3 500g 離心2－5分鐘，沉淀柱料。 4 取出上清。部分用于SDS-PAGE 蛋白電泳 洗膠： 1 加入5倍體積起始緩沖液，攪拌5分鐘 2 500g 離心2－5分鐘，沉淀柱料。 3取出上清。部分用于SDS-PAGE 蛋白電泳 4再洗兩次柱料（一共3×5柱床起始緩沖液）。記得取出上清，部分用于SDS-PAGE 蛋白 電泳 洗柱： 1 加入2倍體積洗脫緩沖液（20mM Na2HPO4 /0.5MnaCl/10mM咪唑/PH7.4）攪拌5分鐘 2再次500g 離心2－5分鐘，沉淀柱料。 3再洗四次柱料（一共5×2柱床洗脫緩沖液）。記得取出上清，部分用于SDS-PAGE 蛋白電泳，280nM吸光值，ELISA，WESTERN 利用流速和重力純化： 1 在柱子底部加上濾器 2 加水排氣 3 加柱帽，去除殘余水。推薦是Z多2 Ml柱料就可以了 樣品結合： 1 倒膠進入柱子 2 小心上樣，用波棒室溫攪拌5－30分鐘 3 打開柱帽，收集流出峰用于分析 洗膠： 1 加入5倍體積起始緩沖液，收集流出液用于SDS-PAGE 蛋白電泳 2再洗兩次柱料（一共3×5柱床起始緩沖液）。記得取出上清，部分用于SDS-PAGE 蛋白 電泳 洗柱： 1 加上柱帽，加入2倍體積洗脫緩沖液（20mM Na2HPO4 /0.5MnaCl/10mM咪唑/PH7.4）攪拌5分鐘。打開柱帽，收集流出峰 2再洗四次柱料（一共5×2柱床洗脫緩沖液）。記得取出上清，部分用于SDS-PAGE 蛋白電泳，280nM吸光值，ELISA，WESTERN 注意：0.5M咪唑的280nM吸光值＝0.5 常見問題： 1 樣品太粘稠 答：核酸存在影響，可以繼續(xù)超聲，加入RNA酶至10ug/ml DNA酶至5ug/ml。然后冰浴1 0－15分鐘?；蛘咭部梢杂米⑸淦鱽砘爻湫＿@樣可以防止堵塞柱料。 2 平衡時樣品洗脫了下來 答: 檢查PH和緩沖液成分，如果緩沖液成分不正確，EDTA加入，強還原劑加入，都會導致這個現(xiàn)象出現(xiàn)。 加大膠的量，如果膠料承載能力過頭，也繪出出現(xiàn)這現(xiàn)象。 準備新鮮的柱料，如果柱料斷裂，也掛不上蛋白。 3 在洗脫液中不含有組氨酸蛋白 答：如果SDS-PAGE 蛋白電泳已經(jīng)發(fā)現(xiàn)蛋白存在于超聲液中 超聲可能不完全?？梢杂蔑@微鏡觀察超聲情況。AD260/280比值。（通常是超聲前將10mg/ml溶菌酶加入25mM Tris-HCL，PH6-8），避免發(fā)泡以降解融合蛋白。 蛋白可能是是包含體，可以使用4－6M鹽酸呱或者4－8 M尿素溶解。 尿素溶解的可以進行SDS-PAGE 蛋白電泳，鹽酸呱溶解的不可以進行SDS-PAGE 蛋白電泳，必須換緩沖液。 洗脫液濃度太稀，可以加大咪唑濃度或者降低PH 來決定Z佳洗脫條件如果在平衡前的洗柱發(fā)現(xiàn)了目的蛋白，證明起始緩沖液中的咪唑濃度太高，可適當降低。 4 考馬氏亮藍或者銀染發(fā)現(xiàn)多條帶 答：加入蛋白激酶YZ劑。可能是蛋白降解。用凝血酶切割前必須去除絲氨酸蛋白酶YZ劑采用梯度咪唑來洗脫蛋白。在平衡洗脫液中加入10mM咪唑可以洗脫大量雜質(zhì)而不會洗脫融合蛋白。低于500mM咪唑可以洗掉絕大部分雜質(zhì)。 在洗脫步奏往起始緩沖液加入去垢劑（2％TRITON x-100或者2％Tween20）50% 葡萄糖，20mM B-巰基乙醇。記得雜質(zhì)通常沒有特意結合能力，可以改變緩沖液來洗脫。 如果雜志和目的蛋白有相同結合能力，那就不能用于純化。因此可以使用別的純化系統(tǒng)，例如含有GST尾巴就用谷胱甘肽瓊脂糖4B 柱料再生，清潔和保存 柱料再生： 1 使用0.05M EDTA，0.5M NaCl來洗脫鎳離子。然后用3柱床的0.5M NaCl來洗干凈EDTA 2如果是鐵離子可以用0.05M EDTA泡過夜 3 這一步可以洗脫上面未能洗脫的殘余結合蛋白 清洗柱料： 1 0.5倍柱床2M NaCl，反向洗脫10－15分鐘 2 1M NaOH洗1小時去除殘余蛋白 3 每一步都要用3倍柱床起始緩沖液清洗 4 4倍柱床70%乙醇洗脫強親水蛋白和脂類蛋白。 也可以使用2倍柱床去垢劑。0.1-0.5%非離子去垢劑溶于0.1M乙酸。浸泡1－2小時。Z后用5個柱床的70％乙醇去除去垢劑。 清潔： 1 盡可能去除微生物 2 0.5-1M NaOH反向流動半小時 3 再用3－5倍柱床消毒的起始緩沖液平衡 4 這個清潔步奏不一定能夠提高純化能力 保存： 長期保存于20％乙醇或者0.01M NaOH 于4度 以上來自百度文庫，希望能幫到你。

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