尿激酶是從新鮮人尿中提取的，或從人腎組織培養(yǎng)中獲得的一種酶蛋白，是臨床上一種常用的溶解血栓的藥物。它由高分子量尿激酶 (Mw=54000) 和低分子量尿激酶 (Mw=33000) 組成的混合物。

為使尿激酶達(dá)到ZJ分離效果，本應(yīng)用使用粒徑2 μm的TSKgel UP-SW2000超GX液相尺寸排阻色譜柱與G2000SWXL色譜柱，對(duì)尿激酶進(jìn)行了對(duì)比分析。

溶液的配制

色譜流動(dòng)相配制：0.2 mol/L磷酸二氫鈉水溶液，用磷酸調(diào)pH至3.0 。

樣品：尿激酶測(cè)試方法優(yōu)化溶液濃度：2.5 mg/mL

分析條件

儀器：Thermo Ultimate3000

色譜柱1：TSKgel UP-SW2000 (2μm, 4.6 mmI.D.×30cm)

色譜柱2：TSKgel G2000SWXL (5μm, 7.8 mmI.D.×30cm)

流速：0.18 mL/min for UP-SW2000、0.5 mL/min for G2000SWXL

柱溫：25℃

樣品盤(pán)溫度：10℃

進(jìn)樣量：10 μL

檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器@280nm

分析結(jié)果

圖1.  UP-SW2000色譜柱分離譜圖

圖2.  G2000SWXL色譜柱分離譜圖

結(jié)果與討論：

相較于G2000SWXL色譜柱，TSKgel UP-SW2000對(duì)多聚體、高分子量尿激酶、低分子量尿激酶的分離度均有所提高。

同時(shí)對(duì)比了等量溶質(zhì)不同進(jìn)樣體積，高濃度樣品小進(jìn)樣量，分離度較好一些。UP-SW2000色譜柱可滿足藥典要求：高分子量尿激酶峰面積占90%以上，且與低分子量尿激酶分離度大于1.0。

利用ACE鍵合相的固定相選擇

分離度方程式可以確定影響分離度的參數(shù)：柱效（N）、容量因子（k）和選擇性（α）。

在過(guò)去幾年里，柱效和使用超GX色譜柱（被稱為“UHPLC”色譜柱）作為實(shí)現(xiàn)分離目標(biāo)的手段已得到了極大的重視。

UHPLC已通過(guò)更快速的分離和更快速的方法開(kāi)發(fā)提高實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)力來(lái)證明了其價(jià)值。

然而，選擇性往往被忽視，且其重要性也被強(qiáng)調(diào)柱效所掩蓋。這是令人遺憾的。

在影響分離度的三個(gè)參數(shù)中，選擇性是Z為重要的。

（參見(jiàn)圖1）通過(guò)利用柱效和選擇性，通?？梢詫?shí)現(xiàn)更好和更快的分離。

圖 1：N、α和k對(duì)分離度（Rs）的影響

提高N，α或k可以提高分離度（Rs）。

然而，從這些圖中可以看出，隨著N或k值的提高，對(duì)分離度的改善效果也逐漸降低。

另一方面，提高選擇性（α）則沒(méi)有這個(gè)問(wèn)題，因此其成為開(kāi)發(fā)分離方法時(shí)的Z佳優(yōu)化變量。

在反相色譜中，固定相與分析物之間存在多種相互作用的機(jī)制，這可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。

這些相互作用機(jī)制包括：疏水性結(jié)合、π-π、氫鍵、偶極-偶極和形狀選擇性。

不同類型的鍵合相將提供其中一種或多種相互作用機(jī)制。表1列出了ACE鍵合相和每種可能的主要相互作用機(jī)制，這取決于分析物和流動(dòng)相條件。

表1: 比較不同鍵合相的分離機(jī)制/相互作用                                                                                    

利用鍵合相的選擇性實(shí)現(xiàn)更好的分離。
圖2表明了兩種ACE鍵合相即C18-AR與苯基之間的選擇性差異。
盡管兩種鍵合相提供了強(qiáng)π-π和偶極-偶極相互作用的可能性，但是在其它可能的相互作用機(jī)制（特別是疏水性結(jié)合）的強(qiáng)度方面，它們存在顯著差異。

C18-AR可能具有其它不同的分離機(jī)制，可以為復(fù)雜的混合物帶來(lái)更好的分離效果。對(duì)于其他混合物，可能不是這種情況，這是ACE鍵合相的優(yōu)勢(shì)。

當(dāng)開(kāi)發(fā)分離方法時(shí)，ACE鍵合相可以提供各種可供選擇的重要保留機(jī)制。

非常強(qiáng)大且獨(dú)特的C18-AR和C18-PFP相只有在ACE和ACE Excel色譜柱中可以獲得。
通過(guò)利用柱效和選擇性，可以實(shí)現(xiàn)更好的分離。

圖 2：C18-AR與苯基相之間選擇性差異的比較

色譜柱尺寸： 50 x 2.1 mm, 3 μm
流動(dòng)相：

A= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于水中）；
B= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于甲醇/水中：65:35, v/v）
流速： 0.6 mL/min
溫度： 60 ℃
檢測(cè)： UV 214 nm
梯度： 5分鐘內(nèi)從3至B，并持續(xù)1分鐘。

樣品：
1. 甲硝唑
2. 3-羥基苯甲酸
3. 苯酚
4. 苯甲醇
5. 咖啡茵
6. 水楊酸
7. 喹喔啉
8. 苯甲酸
9. 奎寧
10. 非那西丁
11. 1,4-二硝基苯
12. 1,3,5-三硝基苯
13. 呋塞米
14. 1,3,5 -三甲氧基苯
15. 吡羅昔康
16. 卡維地洛
17. 苯甲酸乙酯
18. 去甲替林

C18-AR相的疏水性更大，這可以為色譜峰對(duì)（13,14）和（15,17）提供更多的保留值和更佳的選擇性。還要注意C18-AR與苯基相的洗脫順序有很多變化。

圖3給出了鍵合相選擇能力的另一實(shí)例。

一個(gè)分離是用C18鍵合相的UHPLC色譜柱完成，另一個(gè)分離是用C18-PFP鍵合相的UHPLC色譜柱完成。

C18-PFP鍵合相提供的額外分離機(jī)制，使得總體分離效果更佳出色。

圖 3：ACE Excel可以獲得zhuo越的分離度和峰形：藥物及其相關(guān)物質(zhì)的UHPLC結(jié)果

條件
色譜柱尺寸：50 x 2.1mm
流動(dòng)相：

A = 5mM甲酸（溶于水中）
B = 5mM甲酸（溶于甲醇中）
梯度：5分鐘內(nèi)從3至B
流速：0.6 mL/min
溫度：40 ℃
檢測(cè)：UV 254 nm

樣品
1. 對(duì)乙酰氨基酚
2. 氫氯噻嗪
3. 甲基苯基亞砜
4. 甲基苯砜

在C18 UHPLC色譜柱和C18-PFP色譜柱上同樣快速地產(chǎn)生色譜圖。

然而，C18-PFP色譜柱可以為色譜峰對(duì)（13,14）和（15,17）提供更佳的選擇性，因此能夠提供優(yōu)越的總體分離性能。