殼聚糖及其測(cè)定

殼聚糖是目前研究最多的多糖類天然高分子材料，對(duì)于生物體來(lái)說(shuō)，殼聚糖具有優(yōu)良的生物相容性和降解性。將其植入人體后，可被人體組織中的酶緩慢吸收，是用來(lái)制作縫線和創(chuàng)傷覆蓋材料的優(yōu)秀高分子材料。由于其優(yōu)越的性能，使得殼聚糖在化工、 輕工、 醫(yī)藥、 食品及環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域中的開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究十分活躍。

殼聚糖的學(xué)名為β-（1，4）聚-2-氨基-D-葡萄糖，是甲殼素最重要的衍生物,是除蛋白質(zhì)以外含氮量MAX的有機(jī)氮源,也是自然界中僅有的堿性多糖，其相對(duì)分子量通常在10萬(wàn)-30萬(wàn)，但幾乎不溶于水，其中分子量是影響殼聚糖溶解性的主要因素之一，分子量越低其溶解性就越好。

凝膠色譜法(GPC)是測(cè)定殼聚糖相對(duì)分子質(zhì)量及其分布的常用方法，這將有助于推動(dòng)殼聚糖作為生物醫(yī)用材料的選擇和設(shè)計(jì)。

應(yīng)用案例——GPC測(cè)定殼聚糖

本案例基于Waters1515凝膠色譜儀，搭配Ultrahydrogel色譜柱，對(duì)市售殼聚糖的相對(duì)分子量及分布進(jìn)行計(jì)算。

1、儀器

▲Waters1515凝膠色譜儀，配示差檢測(cè)器

2、標(biāo)準(zhǔn)品

聚乙二醇標(biāo)準(zhǔn)品套組

3、實(shí)驗(yàn)條件

01RI流通池溫度

40 °C

02流動(dòng)相

50 mM 的醋酸+100 mM 硝酸鈉緩沖液

03流速

0.45 mL/min

04色譜柱

Waters Ultrahydrogel 2000柱，7.8 ×300 mm

05柱溫

40 °C

06樣品稀釋劑

50 mM 的醋酸+100 mM 硝酸鈉緩沖液

07進(jìn)樣量

50 μL

08數(shù)據(jù)處理軟件

Empower QS +GPC計(jì)算模塊色譜數(shù)據(jù)軟件

09樣品處理

1 mg/mL的殼聚糖

4、結(jié)果與討論

殼聚糖樣品的色譜圖如下：

圖1. 殼聚糖樣品色譜圖

利用Empower QS中GPC選項(xiàng)的功能，采用標(biāo)樣的保留時(shí)間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，來(lái)計(jì)算殼聚糖樣品的分子量分布，軟件會(huì)自動(dòng)計(jì)算出對(duì)應(yīng)的重均分子量(Mw)、數(shù)均分子量(Mn)、多分散性等相關(guān)參數(shù)。

連續(xù)6針進(jìn)樣的重復(fù)性色譜圖如下，通過(guò)計(jì)算Mw的RSD小于0.2%，表明此方法重復(fù)性良好。

Waters GPC優(yōu)勢(shì)

行業(yè)先導(dǎo)Waters 從 1963 年起就致力于 GPC 技術(shù)的研究和開(kāi)發(fā)，經(jīng)過(guò) 50 多年的發(fā)展，使Waters 成長(zhǎng)為 GPC 技術(shù)的前鋒。
專業(yè) 多項(xiàng)特有技術(shù)加持，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性。
易上手 簡(jiǎn)單、易操作，性能穩(wěn)定，專為高聚物領(lǐng)域量身打造。

參考文獻(xiàn)

[1] 凝膠滲透色譜法研究殼聚糖生物材料酶降解過(guò)程的均勻性

[2] 用GPC研究殼聚糖氧化降解過(guò)程中的分子量及其分布_劉羿君

[3] 殼聚糖作為醫(yī)用高分子綜述-王霞

1、流動(dòng)相

A、流動(dòng)相純度：建議使用色譜純及以上的級(jí)別的流動(dòng)相（乙酸乙酯：環(huán)己烷=1:1或二氯甲烷）。

B、使用前，請(qǐng)務(wù)必要按照凝膠凈化色譜柱上的標(biāo)簽規(guī)格（乙酸乙酯：環(huán)己烷=1:1或二氯甲烷）要求配置相應(yīng)的的流動(dòng)相，流動(dòng)相應(yīng)滿足實(shí)驗(yàn)過(guò)程需求，對(duì)于柱體上標(biāo)有流動(dòng)相為乙酸乙酯：環(huán)己烷=1:1的凝膠色譜柱,流動(dòng)相只能使用（乙酸乙酯：環(huán)己烷=1:1）,尤其是不能使用二氯甲烷作為它的流動(dòng)相,否則將會(huì)對(duì)凝膠色譜柱的填料的膨脹系數(shù)造成影響,從而使得柱子不能夠有效的使用。需要使用0.45微米的濾膜過(guò)濾并超聲脫氣混合均勻。

C、流動(dòng)相的用量:由于方法中的流速為5mL/min，如果實(shí)驗(yàn)樣品的數(shù)量很多，應(yīng)該一次性配好流動(dòng)相充足的量，避免中途在往試劑瓶里添加。否則易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致基線不穩(wěn)。

2、樣品溶劑的選擇

在使用GPC時(shí),請(qǐng)注意樣品溶劑對(duì)凝膠色譜柱的影響, 即，在選擇樣品溶劑時(shí)，應(yīng)該選擇與流動(dòng)相極性相符的溶劑，盡量使用流動(dòng)相作為樣品溶劑。

3、輸液泵壓力偏高

如發(fā)現(xiàn)控制面板上的輸液泵壓力變大或報(bào)警停泵時(shí)，請(qǐng)將儀器的放空濾片座卸下來(lái)用流動(dòng)相超聲清洗10~20min后，再安裝上使用。

4、在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)不使用GPC凝膠系統(tǒng)時(shí)

請(qǐng)您先用對(duì)應(yīng)的流動(dòng)相將凝膠色譜柱沖洗10～20min，然后取下，用特有的聚四氟堵頭將其兩端封好，在下次使用時(shí)再重新安裝上，然后以其所使用的流動(dòng)相沖洗十分鐘以上（使其基線達(dá)到平穩(wěn)）后，在進(jìn)行使用。

5、GPC管路的清洗

若使用GPC儀器做茶葉等顏色較深的樣品時(shí)（當(dāng)回收率降低時(shí)），請(qǐng)每隔半個(gè)月將凝膠凈化色譜柱拆下來(lái)，用一個(gè)不銹鋼兩通替代柱子連接管路，然后把流動(dòng)相換成甲醇：丙酮（1:1），沖洗管路一個(gè)小時(shí)，然后換回流動(dòng)相沖洗二十分鐘，再把凝膠柱安裝上，再做實(shí)驗(yàn)。

6、保護(hù)柱（預(yù)柱）的清洗

當(dāng)回收率降低時(shí)，如有保護(hù)柱（預(yù)柱）的話，用甲醇：丙酮（1:1），低流速反向沖洗二十分鐘。

7、及時(shí)傾倒廢液

請(qǐng)注意及時(shí)處理廢液瓶，以避免廢液過(guò)滿而流出所造成的污染。

8、自動(dòng)液體處理器的維護(hù)

請(qǐng)您在使用過(guò)程中不要隨便移動(dòng)、變更樣品盤上的樣品架，因?yàn)樵撐恢迷诎惭b時(shí)已經(jīng)調(diào)整好，移動(dòng)、變更樣品盤上的樣品架，將可能會(huì)發(fā)生進(jìn)樣針折斷等事故。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束以后，請(qǐng)盡可能的對(duì)其做一些防塵措施，以便延長(zhǎng)其使用的壽命。

9、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的操作

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，請(qǐng)點(diǎn)擊工作站左側(cè)下方的【手動(dòng)操作】按鈕，選擇【GPC信息】項(xiàng)，點(diǎn)擊【輸液泵】中的【停止】按鈕，將輸液泵關(guān)閉后，再關(guān)閉工作站，然后分別將儀器及電腦的電源關(guān)閉。

體積排阻色譜SEC在樣品前處理中，有著獨(dú)特的作用，今天小編就帶您一起探尋一下GPC的原理，以及它在樣品前處理中的出色應(yīng)用，一起來(lái)學(xué)習(xí)吧！

1.定義

體積排阻色譜法（Size exclusion chromatography，SEC）是利用多孔凝膠固定相的獨(dú)特特性，而產(chǎn)生的一種主要依據(jù)分子尺寸大小的差異來(lái)進(jìn)行分離的方法，它又稱為空間排阻色譜法（Steric exclusion chromatography）。

2.分類

流動(dòng)相：水；凝膠過(guò)濾色譜（GFC）

流動(dòng)相：有機(jī)相； 凝膠滲透色譜（GPC）

3.固定相

填料：多孔凝膠（軟性凝膠和剛性凝膠）；

特點(diǎn)1：表面分布大小不一的小孔（如圖）

特點(diǎn)2：凝膠顆粒間存在空隙

4.分離

特點(diǎn)1：

化合物按照分子量大小，分為小分子，中等分子、大分子。

小分子： 能通過(guò)小孔、中孔、大孔、空隙；

中等分子：能通過(guò)中孔、大孔、空隙；

大分子： 被排阻在外，只能通過(guò)填料空隙。

特點(diǎn)2：

分子量越小，越能通過(guò)更多不同的孔徑的孔，分子量越大，只能通過(guò)一些較大孔徑的孔，分子量足夠大完全被排斥在外，而不能通過(guò)孔，只能通過(guò)填料間的空隙。

特點(diǎn)3：

能通過(guò)的孔越多，所走的距離越長(zhǎng)，出峰越慢；能通過(guò)的孔越少，所走的距離越短出峰越快。

5.原理

基于分配理論：

6.確定分子量大小

如同色譜質(zhì)譜的定量分析一樣，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法來(lái)定量未知樣品的分析物質(zhì)的濃度。在GPC中組分從柱中的洗脫體積（Ve）與分子量（M）存在對(duì)應(yīng)關(guān)系lgM- Ve，我們可先通過(guò)配置好的已知分子量的化合物分子，進(jìn)樣后，在凝膠柱上存在對(duì)應(yīng)的洗脫體積，來(lái)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相同色譜條件下，未知的物的分子量，可以通過(guò)其洗脫體積，在準(zhǔn)曲線上找到對(duì)應(yīng)的分子量。

A: 分子量為10⁶， 對(duì)應(yīng)洗脫體積為V₀

B：分子量為10³ , 對(duì)應(yīng)洗脫體積為V₀+V_P

X: 未知物，對(duì)應(yīng)的洗脫體積為V_x， 可求得其分子量大小

7.兩個(gè)極限

極限一：排阻極限

如果要分離的物質(zhì)，分子量足夠大，比填料的ZD孔徑都大，所有分子都將被排斥。

極限二：滲透極限

如果要分離的物質(zhì)，分子量足夠小，比填料的最小孔徑都小，所有分子都被滲透。

結(jié)論：體積排阻色譜只能分離凝膠柱處于滲透極限對(duì)應(yīng)化合物分子量A和處于排阻極限對(duì)應(yīng)化合物分子量B之間的物質(zhì)。

8.舉個(gè)例子（土壤中的多環(huán)芳烴的分離）

圖中的藍(lán)色為為土壤萃取物的紫外吸收曲線，可以發(fā)現(xiàn)，色譜峰型較寬，只出現(xiàn)一個(gè)混雜的色譜峰，如不處理，將難以進(jìn)行定量分析，黑色線為經(jīng)過(guò)SEC處理的土壤提取物，當(dāng)?shù)弥喹h(huán)芳烴流出的時(shí)間后（收集點(diǎn)），在其流出時(shí)間處收集（紅色部位），將收集物在反相液相色譜上分析，得到如下色譜圖：

經(jīng)過(guò)SEC處理的收集物（多環(huán)芳烴），在HPLC上 得到了好的分離，干擾性雜質(zhì)（玉米油、DEHP等）也得到了很好的去除效果。另外GPC得一個(gè)典型的應(yīng)用，就是在農(nóng)藥殘留分析中，去除油脂，大分子蛋白、色素。SEC提供了常規(guī)SPE和LLE難以分離處理的復(fù)雜基質(zhì)樣品的前處理手段。

普魯蘭多糖是一種由出芽短梗霉發(fā)酵所產(chǎn)生的類似葡聚糖、黃原膠的胞外水溶性粘質(zhì)多糖，由于該多糖獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，在醫(yī)藥、食品、石油、化工等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。因其在自然界可被微生物降解利用，不會(huì)引起環(huán)境污染，故被譽(yù)為無(wú)公害塑料。

本應(yīng)用是將HLC-8420GPC凝膠滲透色譜系統(tǒng)和LenS3多角度光散射檢測(cè)器聯(lián)用，采用TSKgel GMPWXL色譜柱對(duì)普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)品的絕 對(duì)分子量、分子量分布及回轉(zhuǎn)半徑 (Rg) 進(jìn)行了表征。

分析條件

儀器:  HLC-8420GPC & LenS3

色譜柱: TSKgel GMPWXL (7.8mmI.D.×30cm, 13μm)

流動(dòng)相:  0.1 M NaNO3

流速:  1.0 mL/min

樣品濃度:  1.095 mg/mL

進(jìn)樣量:  100 μL

溫度:  40℃

樣品:  普魯蘭多糖

分析結(jié)果

圖1  多檢測(cè)器測(cè)試譜圖

（紫色曲線為示差(RI)檢測(cè)器信號(hào)，紅色曲線為10°角光散射(LALS)檢測(cè)器信號(hào)，藍(lán)色曲線為90°角光散射(RALS)檢測(cè)器信號(hào)，綠色曲線為170°角光散射(HALS)檢測(cè)器信號(hào)）

圖2 絕 對(duì)分子量、回轉(zhuǎn)半徑(Rg)及RI隨流出時(shí)間曲線

（紫色曲線為示差(RI)檢測(cè)器信號(hào)，綠色曲線為絕 對(duì)分子量，藍(lán)色為回轉(zhuǎn)半徑(Rg)隨流出時(shí)間曲線）

圖3  分子量分布和累積分布曲線

（黃色曲線為分子量分布曲線，紫紅色曲線為累積分布曲線）