氫（H）和氧（O）—— 兩種簡單的元素組成了是世界上最重要的分子之一水（H2O），它在地球上無處不在，對我們的健康和生存也至關(guān)重要。通常情況下，它含有其他離子，如鈣、鎂和氯化物，這些離子對人體的功能也非常重要。但是，在一些特定情況下，比如制備醫(yī)療使用的注射劑或者其他溶液，就需要使用超純水。

那么怎樣來確保超純水的質(zhì)量呢？

美國藥典 USP<645> 給出了答案，在該標(biāo)準(zhǔn)中說明了如何確定其電導(dǎo)率及如何進(jìn)行分析。

在此過程中首先需要測量電導(dǎo)率和 pH 值的儀器。瑞士萬通推薦使用 Aquatrode plus pH 電極和電導(dǎo)電極。

Aquatrode plus 為復(fù)合pH玻璃電極，適用于低電導(dǎo)率和緩沖能力弱的樣品，如超純水；反應(yīng)時間迅速；具有雙層結(jié)構(gòu)，可以自由選擇參比溶液來適用各種特殊應(yīng)用。

電導(dǎo)電極，帶池常數(shù) c=0.1cm-1，適用于測量較低的電導(dǎo)率（0 至 300μS/cm），例如去離子水等。內(nèi)置溫度傳感器，因此測量溫度不再需要額外的電極。

USP <645> 測定步驟

01  電極校準(zhǔn)。pH 電極用 pH=4 和 pH=7 的緩沖溶液進(jìn)行校準(zhǔn)；電導(dǎo)電極使用 100μS/cm 的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液進(jìn)行校準(zhǔn)。

02  電極校準(zhǔn)后，無需溫度補償即可測量溫度和電導(dǎo)率。測量得到電導(dǎo)率數(shù)值如果低于 USP<645> 中的值，則滿足要求，測量的水樣可以用于醫(yī)療等用途。相反，則需要進(jìn)行下一步。

03  將 100mL 的水轉(zhuǎn)移至外部滴定容器中，將溫度調(diào)節(jié)至 25±1℃。劇烈的攪拌水樣使其吸收空氣中的CO2，然后進(jìn)行測量。當(dāng)電導(dǎo)率在5分鐘內(nèi)的變化不超過 0.1μS/cm 時，記錄數(shù)值進(jìn)行評估。此時的電導(dǎo)率如果低于 2.1μS/cm，測量的水樣可以用于醫(yī)療等用途。相反，則繼續(xù)進(jìn)行下一步。

04  溫度控制在 25±1℃，加入 0.3mL 飽和 KCl 溶液，測量水的 pH 值。pH 值如果介于5和7之間，電導(dǎo)率對應(yīng)了 USP<645> 中的值，則分析通過，測量的水樣可以用于醫(yī)療等用途。如果 pH 值沒有介于5和7之間，則水樣不符合要求，需要舍棄。

USP <645> 的自動化

多步驟的分析非常耗時，為了解決這一問題，瑞士萬通提供了一種自動化解決方案，我們的系統(tǒng)將所有步驟組合成一種方法，實現(xiàn)無人值守的自動化分析，使得您可以將精力放在其他更重要的任務(wù)上。

815 型機器人樣品處理器自動分析樣品

856/867 模塊 (精確測量 pH 值和電導(dǎo)率)

◇ Aquatrode plus 測量準(zhǔn)確的 pH 值

◇ 電導(dǎo)電極測量低電導(dǎo)率

◇ 恒溫容器

◇ 樣品瓶蓋防止樣品吸收CO2（第三步之前）

◇ 攪拌器，使溶液充分吸收CO2

瑞士萬通自動化解決方案，使USP <645> 分析超純水（UPW）的質(zhì)量以全自動和可靠的方式進(jìn)行。在每次分析結(jié)束時，如果超純水 (UPW) 通過測試，則會收到清晰的消息提醒。處理非常簡單，用戶只需看一眼即可知道分析是否通過。

簡介和挑戰(zhàn) 

       制藥行業(yè)嚴(yán)重依賴于塑料包裝材料，以將產(chǎn)品推向市場。藥品的包裝材料包括瓶子、一次性使用的袋 子（例如靜脈輸液、血液或其組分的輸液袋）、預(yù) 充式注射器等，包裝材料中可能含有多種成分（各 種聚合物和添加劑）。必須證明這些包裝材料（及 其結(jié)構(gòu)材料）不會與藥品發(fā)生反應(yīng)，從而影響藥品的適用性。 近來，USP <661>章經(jīng)過修訂，適用范圍更加全面， 能夠用于驗證各種包裝材料和包含多種材料的包裝 系統(tǒng)。 

USP 的總有機碳（TOC）法規(guī) 

       USP 要求對純化水（Purified Water ，PW）和注射用水（Water for Injection ，WFI）進(jìn)行 TOC 測試， USP <643>章對此有完整的說明。純化水和注射用水的 TOC 限值設(shè)定為 0.5 ppm。 

       2016 年 5 月 1 日， USP <661>總章有了重大修訂， 此章標(biāo)題重定為“塑料包裝系統(tǒng)及其結(jié)構(gòu)材料 （ PLASTIC PACKAGING SYSTEMS AND THEIR  MATERIALS OF CONSTRUCTION）”。另外，總章 的 2 個分節(jié)為：

? <661.1>塑料結(jié)構(gòu)材料（Plastic Materials of  Construction） 

? <661.2> 制 藥 用 塑 料 包 裝 系 統(tǒng) （ Plastic  Packaging Systems for Pharmaceutical Use） 

法規(guī)除了描述材料和系統(tǒng)之外，還提出了更廣泛的測試方法和技術(shù)，其中包括 TOC 測試。 

       如上所述，這是為了使用戶了解包裝系統(tǒng)和包裝本 身所使用的材料。因此，修訂的法規(guī)對行業(yè)運營產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響，目前適用于：

? 成品藥制造商 

? 塑料袋、瓶、輸液器具等的制造商包裝藥品的監(jiān)管批準(zhǔn)者負(fù)有達(dá)到本法規(guī)要求的主要職責(zé)。

USP <661>分節(jié) 

<661>有兩個分節(jié)： 

<661.1>塑料結(jié)構(gòu)材料。本節(jié)旨在確保各種材料符 合適用性。本節(jié)專用于各種塑料材料。 

<661.2>藥品用塑料包裝系統(tǒng)。本節(jié)旨在確保含有 一種或多種材料的整個包裝系統(tǒng)符合適用性。

661 的預(yù)期評估 

材料篩選 

? 評估可能的可萃取物和潛在的可浸出物的成分 控制條件下的萃取研究 

? 進(jìn)行Z壞情況的受控的萃?。M）研究，確定萃取物變成可能的可浸出物的程度 

產(chǎn)品評估 

? 對于將要推向市場的包裝/輸送系統(tǒng)中的藥品， 對已確認(rèn)的可浸出物進(jìn)行實際測量

661 的 TOC 限值

滿足 USP <661>法規(guī)的其他 TOC 要求 

進(jìn)行的 TOC 分析： 

? 應(yīng)有 0.2 ppm 檢測限 

? 應(yīng)有 0.2 - 20 ppm 線性動態(tài)范圍

Sievers M9 TOC 分析儀與滿足 USP <661>的要求

       Sievers M9 總有機碳（TOC）分析儀提供良好的可 靠性和快速分析性能，此優(yōu)越性已經(jīng)過時間的檢驗。 分析儀能夠?qū)?TOC 結(jié)果的報告時間縮短 50％，從 而提高了生產(chǎn)效率。 

       Sievers TOC 分析儀能夠幫助在嚴(yán)格監(jiān)管的環(huán)境下 運營的企業(yè)達(dá)標(biāo)，儀器的性能超過了法規(guī)和分析要 求。分析儀的線性范圍廣，對超純水樣品的低濃度 具有高靈敏度，對清潔驗證樣品的高濃度檢測能力也很強。

       M9 分析儀的線性范圍為 0.03 ppb - 50 ppm，有效 地達(dá)到了 USP <661>對檢測限和動態(tài)線性范圍的要求。所有的 Sievers TOC 分析儀都符合純化水和注 射用水的 USP <643>要求。

為了支持分析儀和 USP <661>合規(guī)性，我們提供 NIST 可追溯標(biāo)樣和 ISO Guide 34 與 ISO/IEC 17025 的認(rèn)證標(biāo)樣：

? 準(zhǔn)確度/精確度標(biāo)樣組，8 ppm (STD 770131) 

? 準(zhǔn)確度/精確度標(biāo)樣組，5 ppm (STD 99011) 

? USP <661>線性標(biāo)樣組 (STD 99012) 如有要求，我們還提供線性協(xié)議和電子表格以供參考。 

       上述標(biāo)樣，結(jié)合 Sievers 的故障調(diào)查分析報告 （Failure Analysis Report，F(xiàn)AR），提供了可追溯 性和快速“不合規(guī)（Out of Specification ，OOS）” 調(diào)查。 

       M9 分析儀有實驗室型和便攜式兩種，便于使用。分析儀符合 USP <643>、USP <645>、USP <661>、 USP <1225>、21 CFR Part 11 等法規(guī)要求，包括國際同類標(biāo)準(zhǔn)要求。

參考文獻(xiàn) 

1.USP <661>總章 

2. USP <661.1>和<661.2>分節(jié) 

3. USP 661 簡報： http://www.usp.org/sites/default/files/usp_pd f/EN/meetings.pdf

全文共 1386 字，閱讀大約需要 5 分鐘

AccuSizer? 自動顆粒計數(shù)分析儀可用于蛋白質(zhì)配方優(yōu)化，最 大程度地減少蛋白質(zhì)聚集并執(zhí)行 USP <787> 亞可見顆粒物質(zhì)測試。

簡介

動態(tài)光散射 (DLS) 是檢測蛋白質(zhì)粒徑的標(biāo)準(zhǔn)工具，但該方法不提供濃度信息。AccuSizer? 單粒子光學(xué)傳感技術(shù) (SPOS) 系統(tǒng)可用于檢測聚集蛋白粒徑和濃度，可測量150nm以上的聚集蛋白濃度。圖 1 顯示了單抗產(chǎn)品熱應(yīng)激前后的 Nicomp? DLS 結(jié)果。

加熱后的結(jié)果（藍(lán)色）顯示了高分辨率的多峰結(jié)果，包括從~150 nm開始的較大的聚集峰。AccuSizer 無法檢測到 10 nm 的顆粒，但可以提供 >150 nm聚集蛋白的定量數(shù)據(jù)。在這項研究中，AccuSizer FX Nano 用于研究各種配方穩(wěn)定化學(xué)物質(zhì)如何影響NIST標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的最 終聚集狀態(tài)。AccuSizer FX Nano也可用于 USP <787> 亞可見顆粒物測試1。

材料

使用的蛋白質(zhì)是 NIST 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 8671，批號 14HB-D002，NIST mAb，人源 IgG1k 單抗2。在Nicomp動態(tài)光散射(DLS)系統(tǒng)上，使用35mw激光二極管源，APD檢測器測量蛋白質(zhì)的初次粒徑。在配備兩個傳感器的AccuSizer FX Nano SIS系統(tǒng)上測量蛋白質(zhì)聚集體:LE-400; 0.5 – 400 μm 和 FX Nano; 0.15 – 10 μm.SIS進(jìn)樣器提供精確的樣品體積，最 小進(jìn)樣量低至100 μL且可回收。

iFormulate3（圖 2）板預(yù)裝了配方，由 DoE 設(shè)計用于合理的配方開發(fā)，用于測試配方的聚集水平。評估了蛋白配方的四個主要影響因素；pH、離子強度、緩沖液和穩(wěn)定劑濃度。

使用的 iFormulate 板測試了以下影響因素：

? pH：5 – 7.6

? 離子強度：0 – 200 mM NaCl

? 海藻糖穩(wěn)定劑：0 – 10 %

? 緩沖液濃度：10 – 50 mM

方法

將 NIST mAb 解凍并稀釋至 1 mg/mL，將 160 μL 過濾的去離子水添加到 iFormulate 板的每個孔中。每孔加入40 μL NIST mAb。將培養(yǎng)皿置于60°C(剛好低于蛋白質(zhì)熔點)的烤箱中24小時。使用 AccuSizer 顆粒計數(shù)器分析每個孔。將>0.15 μm(總)和>0.53 μm的顆粒計數(shù)數(shù)據(jù)提交給iformula，由iformula進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和穩(wěn)定性建模。

結(jié)果

數(shù)據(jù)使用帕累托分析方法處理，帕累托分析方法在多影響因素下十分有效。帕累托分析給出了影響因素排名和影響因素之間的相互作用。圖 3 和圖 4 分別顯示了 >0.15 μm 和 >0.53 μm 的帕累托分析。顏色表示配方變量對增加的顆粒計數(shù)的相對重要性，藍(lán)色 = 重要，灰色 = 臨界，紅色 = 不太重要。

下面的結(jié)果顯示了不同條件下聚集效應(yīng)的 3D 響應(yīng)曲面圖。這種設(shè)計空間提供了通過檢測在兩個粒徑范圍內(nèi)顆粒濃度的方法，以此來確定可最 大限度減少聚集配方。圖 5 和圖 6 顯示了在保持緩沖液和 NaCl 濃度不變的情況下，改變 pH 值和穩(wěn)定劑（海藻糖）的結(jié)果。

圖5 pH值和穩(wěn)定劑的影響>0.15μm

圖6 pH值和穩(wěn)定劑的影響>0.53μm

圖 7 和圖 8 顯示了不同 NaCl 和穩(wěn)定劑（海藻糖）濃度的結(jié)果，同時保持緩沖液濃度穩(wěn)定且 pH 值從 5.91 略微變化到 6.3。

圖7 NaCl和穩(wěn)定劑的作用>0.15μm

圖8 NaCl和穩(wěn)定劑的作用>0.53μm

然后對這些結(jié)果以及此處未顯示的其他結(jié)果進(jìn)行整理，圖9和圖10顯示了最 小粒子數(shù)優(yōu)化圖。

圖9 顆粒最 小化圖>0.15μm

圖10 顆粒最 小化圖>0.53μm

結(jié)論

此處顯示的結(jié)果表明，可最 大程度減少顆粒計數(shù)并因此減少蛋白質(zhì)聚集的最 佳化學(xué)制劑為：

pH = 6.1 – 6.3

NaCl = 40 – 70 mM

海藻糖 = 7 – 8%

緩沖液 = 50 mM

AccuSizer也可用于在≥10和25μm的條件下進(jìn)行USP＜787＞測試，并可使用A2000 USP微孔板分析儀實現(xiàn)自動化。

LC-MS的強大功能已經(jīng)得到了生物醫(yī)學(xué)實驗室的認(rèn)可。1,2現(xiàn)在的LC-MS儀器已經(jīng)從研究到常規(guī)臨床實驗室范圍廣泛使用，并有效應(yīng)用于以下領(lǐng)域：

· ZL藥物監(jiān)測 - 測量血漿，血液或組織中的藥物（例如免疫YZ劑） 

· 濫用藥物測試 - 測量在尿液或唾液中的藥物（例如哌替啶，等等） 

· 激素測試 - 測量血清或血漿中的激素（例如類固醇或甲狀腺激素） 

· 生物胺分析 - 測量血漿或尿液中的生物胺（如兒茶酚胺） 

· 新生兒篩查 - 通過使用LC-MS水平監(jiān)測氨基酸和酰基肉堿檢測可ZL的疾病

LC-MS儀器相對于其他分析工具具有很強的吸引力，原因在于該技術(shù)能夠以非常高的靈敏度同時測量多種復(fù)雜分析物。此外，速度和信任也是患者護(hù)理的關(guān)鍵因素，同時成功的LC-MS生物醫(yī)學(xué)分析具有高度靈敏度，可追溯性強和數(shù)據(jù)可靠的特性。因此，對于生物醫(yī)學(xué)用LC-MS工作流程中的試劑水及其水在LC-MS成功分析實踐中的作用將通過以下三個方面進(jìn)行介紹。

 靈敏度 

超純水被廣泛用于LC-MS流程的各個環(huán)節(jié)（圖1），所以是導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)鬼峰，基線噪音和高M(jìn)S背景等這些原因的主要污染源。同時也會使儀器或方法的靈敏度下降，使一些低濃度分析變的困難3。為了避免干擾，確保檢測到的分析物是來自樣品，而非來自實驗用水4，實驗過程需要使用高質(zhì)量的超純水，避免數(shù)據(jù)偏差和再次污染5。

Figure 1. The role of water in the LC-MS laboratory 

超痕量分析是LC-MS生物醫(yī)學(xué)分析中的一個應(yīng)用領(lǐng)域，在激素檢測中，相較于其他實驗成分，其中水的使用量是非常大的。因此將Milli-Q水（電阻率18.2MΩ·cm（25℃），TOC<5ppb）作為激素中雌二醇分析的實例進(jìn)行分析。這個實驗的結(jié)果如圖2所示，其中MRM色譜圖顯示Milli-Q?水中不存在雌二醇，確保了分析方法的低檢出限，使用標(biāo)準(zhǔn)加入法測得雌二醇濃度為265.40ng/L。 

前體離子273m/z和碎片離子255m/z用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）ESI+轉(zhuǎn)換。HPLC和MS以及LC-MS/MS的儀器參數(shù)以及制備Milli-Q?水所用水源，見圖2。

Figure 2. MRM chromatogram (ESI+) of estradiol in a sample and in Milli-Q?water.

 可追溯性 

水純化系統(tǒng)的在線監(jiān)測功能使科學(xué)家們確定他們所使用的水是否符合LC-MS分析的要求。但是，當(dāng)問題產(chǎn)生時，說明LC-MS分析過程中已經(jīng)出現(xiàn)了污染，找到并消除其來源至關(guān)重要，因為污染隱患來源非常多，使用LC-MS實驗時收集記錄的水質(zhì)參數(shù)的數(shù)據(jù)可以在特定的日期與污染源聯(lián)系起來，從而促進(jìn)水質(zhì)評估和問題的排查。

而且，在所有臨床實驗室中，可追溯性都是質(zhì)量管理體系中的重要需求，能使實驗室符合認(rèn)證，例如，ISO15189：2007標(biāo)準(zhǔn)或CLSI?C3—A4。所以，在這種情況下用電子方式記錄水質(zhì)參數(shù)的方法是一種確保高質(zhì)量認(rèn)證的解決方案。

 可靠性 

為了滿足LC-MS生物醫(yī)學(xué)實驗室的要求，水源必須可靠。所以水純化系統(tǒng)不僅要生產(chǎn)高質(zhì)量的實驗用水，而且這個質(zhì)量必須始終如一。為確保水質(zhì)的一致性，使用在線監(jiān)測工具。水中的離子含量通過電阻率測量來評估，通常電阻率18.2MΩ·cm（25℃）的水表示不含離子雜質(zhì)。 

為了檢測有機污染物程度，可用可氧化總有機碳（TOC）計算;TOC低于5ppb的水（或μg/L）適用于LC-MS實驗。因此，要檢測水質(zhì)的穩(wěn)定性需要連續(xù)監(jiān)測Milli-Q?水質(zhì)的電阻率和TOC參數(shù)。圖3顯示了Milli-Q?系統(tǒng)提供的水質(zhì)穩(wěn)定性在線監(jiān)測數(shù)據(jù)。

Figure 3. Levels of Resistivity (MOhm·cm) measured continuously and TOC (ppb) measured every 3 minutes as a function of volume produced by a Milli-Q? water system. Di?erent colors refer to data obtained for three di?erent sets of consumables installed by turns. 

 結(jié)論 

超純水適用并符合LC-MS生物醫(yī)學(xué)分析實驗的要求，而且良好的水質(zhì)對實驗的高質(zhì)量和穩(wěn)定性至關(guān)重要。臨床實驗室LC-MS實驗 可以使用Milli-Q?水凈化系統(tǒng)即能符合LC-MS儀器高靈敏度的要求還可以獲得可靠和可追溯的分析結(jié)果。

References

1. K. S-Y. Leung, B. M-W. Fong, LC–MS/MS in the routine clinical laboratory: has its time come? Analytical and Bioanalytical Chemistry, 406, 2289-2301 (2013). 

2. M. Himmelsbach, 10 years of MS instrumental developments--impact on LC-MS/MS in clinical chemistry, J. Chromatogr. B, 883– 884, 3– 17 (2012). 

3. A. Khvataeva-Domanov, S. Mabic, Four Ways to Better Water Quality in LC-MS, R&D Magazine, (2015); http://www.rdmag.com/articles/2015/09/four-ways-better-water-quality-lc-ms 

4. CLSI?C62-A - Liquid-Chromatography-Mass Spectrometry methods; approved guideline, Johns Hopkins Medical Institutions, First Edition, 5.3.1, 34, (2014); http://shop.clsi.org/chemistry-documents/C62.html 

5. Controlling Contamination in UltraPerformance LC?/MS and HPLC/MS Systems, Waters Corporation; http://www.waters.com/webassets/cms/support/docs/715001307d_cntrl_cntm.pdf 

6. B. Keller, J. Sui, A.B. Young, R.M. Whittal, Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry, Anal. Chim. Acta, 627, 71-81 (2008). 

7. M. Vogeser, C. Seger, Pitfalls associated with the use of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in the clinical laboratory, Clin. Chem. 56, 1234-1244 (2010). 

8. Millitrack? e-Solutions, A unique set of data management and monitoring software solutions for water purification systems, MilliporeSigma; www.emdmillipore.com/millitrack-esolutions