自新冠mRNA疫苗成功上市以來，脂質納米粒（Lipid nanoparticle，LNP）已成為mRNA、siRNA、pDNA等核酸的優(yōu)先遞送載體，廣泛用于mRNA疫苗及治愈。微流控技術是目前制備核酸脂質納米粒常用的技術，包封率則是評價其制備效果的重要指標之一，下面就為大家介紹使用RiboGreen測定RNA-LNP包封率的方法。

1 RiboGreen檢測RNA-LNP包封率的原理

1.1RNA-LNP包封率（Encapsulationefficiency，EE）：包裹在脂質納米粒內(nèi)部的RNA占RNA-LNP溶液中全部RNA的比例。

1.2 RiboGreen檢測RNA原理：RiboGreen是一種用于定量檢測溶液中RNA含量的超敏感熒光核酸染料，當RiboGreen熒光染料處于溶液狀態(tài)時，幾乎沒有熒光活性，與RNA結合時，其熒光活性將增加1000倍。RiboGreen-RNA復合物的熒光激發(fā)波長約500nm，發(fā)射波長約525nm，通過酶標儀，建立已知濃度RNA的標準曲線，即可得到樣品RNA濃度。

1.3 RiboGreen檢測包封率原理：分別測定LNP-RNA溶液中游離RNA濃度，以及用Triton-100破壞LNP結構后，溶液中全部的RNA濃度，兩者的差值就是包封在LNP內(nèi)部的RNA濃度。通過以下公式即可計算得到包封率結果。

圖1核酸脂質納米顆粒的示意圖

2操作要點

2.1制備Buffer

1X TE Buffer：使用試劑盒中20X TE Buffer稀釋。

2% Triton-TE buffer：使用Triton-100與1X TE buffer以體積比1：50配制。

2.2添加RNA-LNP樣品至全黑96孔板

根據(jù)制備時RNA的量，可以大致計算需要稀釋的倍數(shù)。例如，已知 mRNA的原始質量或濃度，使用銘汰MicroFlow S進行RNA-LNP合成，根據(jù)稀釋、超濾等處理后的最終體積，即可估算大致總RNA濃度。同時，假設90%的包封率，即可估算游離RNA濃度。然后根據(jù)標曲的濃度計算需要稀釋的大致倍數(shù)。

這樣我們就可以使用1X TE buffer將RNA-LNP稀釋適合倍數(shù)以檢測LNP外游離RNA濃度，使用2% Triton-TE buffer將RNA-LNP稀釋適合倍數(shù)以檢測總RNA濃度，建議每項檢測至少兩個不同稀釋倍數(shù)。

然后，分別移取100 μL稀釋后的樣本，添加到全黑96孔板。

2.3標樣添加

一般直接使用試劑盒中100 μg/mL的RNA標樣，也可以使用與待測樣本類似的RNA標樣來建立標準曲線?？梢韵扔?X TE buffer將原始標樣稀釋到工作濃度4 μg/mL，然后參考表1的體積比，配制為一定濃度梯度的標樣。分別移取各濃度的標樣100 μL，添加到全黑96孔板中。

注：*最終RNA濃度考慮了步驟2.4添加RiboGreen染料后的濃度

當RNA-LNP樣品及特定濃度的標樣添加到96孔板后，需要在37℃下避光孵育10 min，以使RNA-LNP在Triton buffer中充分裂解。

2.4 RiboGreen染料添加

把試劑盒中RiboGreen試劑，使用1X TE Buffer按照1：100的比例稀釋，例如需要2000 μL RiboGreen染料，可將20 μL的RiboGreen試劑添加到1980 μL的1X TE Buffer中。然后各取100 μL加入到已經(jīng)加有樣品的96孔板中，37℃下避光孵育5min。

圖2 樣品添加

2.5酶標儀檢測

打開酶標儀，選擇熒光模式，激發(fā)光485nm，發(fā)射光528nm，讀數(shù)，記錄數(shù)據(jù)。

2.6數(shù)據(jù)處理及分析

    將每個樣本測得的熒光值減去空白熒光值，即可得到實際熒光值。根據(jù)標樣的熒光值和濃度梯度，繪制標準曲線，得到回歸方程。把樣品熒光值代入回歸方程，乘以稀釋倍數(shù)，即可得到樣本的RNA濃度。根據(jù)1.3中包封率公式計算得到包封率結果。

圖3 標準曲線

3 小結

準確的包封率測定對于評價RNA-LNP的包封效果至關重要，影響著后續(xù)細胞實驗和動物實驗的開展。RNA-LNP包封率測定一般使用商業(yè)化的試劑盒，雖然操作環(huán)節(jié)較多，但只要細心規(guī)范，操作起來也并不難，相信大家可以得到準確的實驗結果。

納米藥物制備系統(tǒng)

應用范圍：

在我們使用微流控或其他方法合成核酸脂質納米粒后，成品溶液常常因有機溶劑的存在而不穩(wěn)定。以常見的微流控水相、有機相合成比3:1為例，有機相溶劑常使用無水乙醇，在混合后仍然有高達25%的含量。高濃度的乙醇將逐漸破壞溶液中的納米粒子，使其粒徑逐漸增大。有的甚至能在短短數(shù)小時內(nèi)由50 nm增長到200 nm，嚴重影響實驗結果和方案評估，所以合理、及時的后處理尤為重要。通常而言，后處理等同于除溶劑，但一般也會對溶液中的納米粒子進行粒徑測定。 粒徑測定通常使用動態(tài)光散射粒度儀，需要注意的是，不同品牌的粒度儀對于同一個樣品的檢測結果會有些許差別。另外，在檢測過程中，需要注意待測液體的濃度和溫度對結果造成的影響：一般而言，濃度過高的液體因散射光被大量粒子阻擋，所測出的粒徑偏差較大；而溫度決定了粒子布朗運動強度，溶液溫度沒有平衡前也會影響粒徑的檢測結果。 除溶劑則通常采用超濾或透析。超濾為主動式，速度快；透析為被動式，速度慢。有些科研工作者可能會擔心超濾的方式過于猛烈，導致納米粒子的破壞。對于這一點其實沒有必要過于擔心，一方面在超濾的過程中，并不會完全將溶劑去除——通常在剩1 – 2 mL時就停止離心；另一方面超濾相對于透析更快，雖有極少量的納米粒子破壞，卻避免了有機溶劑長期留存帶來的影響，兩害取其輕，超濾仍舊是除溶劑的有效辦法。

超濾管

  測粒徑和除溶劑的具體步驟如下：

1. 完成納米粒子的合成后（假定成品1 mL），立刻用去鈣去鎂的D-PBS進行40倍稀釋，體積為40 mL。稀釋后取0.5 – 1 mL左右進行粒徑測定，剩余39 – 39.5 mL執(zhí)行剩余步驟以除溶劑。2. 將剩余溶液倒入超濾管中，室溫（20℃）下以2000×g的速度離心5 – 30 min，離心時間依超濾管孔徑大小而有所區(qū)別，第一次嘗試時可以密切關注超濾管中的液體，以剩余1 – 2 mL為停止信號。3. 取出超濾管，將下方液體倒出，在超濾管上方繼續(xù)添加剩余溶液（如果步驟2沒有完全倒入超濾管中的話），并用移液槍吸取管中液體沖洗濾膜數(shù)次，按步驟2的參數(shù)再次超濾。4. 重復步驟2 – 3，直至溶液全部濃縮至1 mL左右。用移液槍吸取管中液體沖洗濾膜數(shù)次后將液體全部吸出轉移并在生物安全柜中過0.2 μm濾膜除菌（如不進行生物實驗則無需除菌）后，即為最終品。得到最終品后，就可根據(jù)使用者的實際需求稀釋成相應濃度，并進行動物或細胞實驗。

隨著納米技術的不斷發(fā)展，納米藥物在醫(yī)藥領域的應用越來越廣泛，尤其在疫苗的研發(fā)、基因治療，腫瘤靶向等方面顯現(xiàn)了不可替代的優(yōu)勢。锘海生物為科研工作者和企業(yè)提供全面的納米藥物制備、生產(chǎn)及檢測服務，囊括了納米藥物研發(fā)過程中，從處方篩選到制劑表征的全線過程。為客戶簡化流程，節(jié)約時間成本，同時提供高質量的數(shù)據(jù)分析與技術支持服務。 

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在上一期的核酸脂質納米粒主題文章中，我們列舉了后處理的步驟及細節(jié)，其中一項關鍵內(nèi)容——超濾除溶劑——使用的就是市面上較為常見的超濾管。但看似相同的超濾管實際上有多種規(guī)格，通常以相對分子質量（Dal或kD）來標示，如10 kD、50 kD、100 kD等。數(shù)字越大，代表了濾膜的孔徑越大，截留下來的物質分子量也相應更大。

在我們銷售微流控儀器時，就經(jīng)常會接到客戶的提問：究竟多少規(guī)格的超濾管適合自己制作的核酸脂質納米粒呢？同時，我們也發(fā)現(xiàn)，盡管有些客戶包裹的是相似長度的核酸，使用的超濾管規(guī)格卻完全不同。因此在這篇文章中，我們將通過計算來確定使用的超濾管規(guī)格。

一般而言，為了保證我們需要的物質能夠幾乎完全被截留，選用的規(guī)格大小在目標物質的分子量的1/3甚至1/4較為合適（這是在蛋白組學、生物化學等領域的一個經(jīng)驗值，也可根據(jù)實際產(chǎn)物進行調(diào)整）。規(guī)格過大會導致大部分目標產(chǎn)物流失；規(guī)格過小則會導致超濾時間急劇增大，這對于在有機溶劑中不穩(wěn)定的核酸脂質納米粒而言是致命的。

確定了規(guī)格大小和目標物質分子量之間的比例后，下一步需要確定目標物質的相對分子質量。在這里，首先需要明確相對分子質量（Mr）單位Dal與物質的摩爾質量（M）單位g/mol之間的關系。相對分子質量是該分子的質量與“一個12C原子質量的1/12”的比值；摩爾質量則是單位物質的量的物質所具有的質量——看似非常繞，但實際上兩者的數(shù)值是相等的。例如膽固醇的摩爾質量為386.65 g/mol，而一個膽固醇分子的相對分子質量也為386.65 Dal，其中不同就是摩爾質量是一個宏觀整體的概念，而相對分子質量則需要確定對象的具體情況，對于核酸而言就是要確認組成核酸的堿基數(shù)量。在氮磷比計算一文中，我們提到堿基的平均摩爾質量為330 g/mol，所以一個堿基的相對分子質量為330 Dal。

假設我們的mRNA具有n個堿基，則其相對分子質量為330n Dal，如果我們希望這個值為超濾管規(guī)格的3倍，則意味著超濾管的規(guī)格不得大于110n Dal，由此我們就可以得到下方一個簡單的表格。

由此我們可以看到，其關系直接明了。在實際使用過程中，超濾管通常不會超過100 kD，因此，只要我們的核酸堿基超過909個，便可以使用100 kD的超濾管。當然，為了保險起見，也可以使用50 kD超濾管。需要注意的是，以上均以mRNA為例。如果為短鏈siRNA，通常在一個納米粒中會有多個的siRNA鏈，因而在計算的時候要乘以相對應的數(shù)量。

隨著納米技術的不斷發(fā)展，納米藥物在醫(yī)藥領域的應用越來越廣泛，尤其在疫苗的研發(fā)、基因治療，腫瘤靶向等方面顯現(xiàn)了不可替代的優(yōu)勢。锘海生物為科研工作者和企業(yè)提供全面的納米藥物制備、生產(chǎn)及檢測服務，囊括了納米藥物研發(fā)過程中，從處方篩選到制劑表征的全線過程。為客戶簡化流程，節(jié)約時間成本，同時提供高質量的數(shù)據(jù)分析與技術支持服務。

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在前幾期的內(nèi)容當中，我們分別介紹了實驗前后相對重要的背景知識。本期終于輪到了整個實驗中較為重要的步驟——合成。合成會涉及到相應的儀器，即納米藥物制備系統(tǒng)。該系統(tǒng)操作簡單、制備快速，深受廣大用戶的喜愛。同時，也得益于相對較少的參數(shù)，使得客戶能夠在培訓短短幾個小時后，就可以上手進行熟練操作。下面將對較為重要的參數(shù)如流速比、總流速等對結果的影響進行介紹。需要注意的是結論以以往實驗結果作為依據(jù)，不一定具有普遍性，在實際實驗中仍可能得到與結論不同的結果。

流速比：通常水相比例越高，粒徑越小

合成納米粒子的原料通常根據(jù)溶劑的種類分為有機相和水相。通常而言，水相比例越高，意味著同時流經(jīng)的有機相更少，因而能夠形成納米粒子的“原料”——脂質——的數(shù)量就越少，因而圍成球狀后的體積也相應更小。但在不斷增加水相比例后，有機相含量變化變得不那么劇烈，因而對粒徑的影響也逐漸減弱。

圖1：常規(guī)脂質體（liposome）在使用納米藥物制備系統(tǒng)時，通過調(diào)整流速比得到的不同粒徑結果[1]。

總流速：通常流速越高，粒徑越小，但不可無限制縮小

相對于總流速，上文提到的流速比的影響相對明顯且直接，在摸索條件的過程中會先被定下來。之后如果想要調(diào)整粒徑，可部分依靠總流速的調(diào)節(jié)。在納米藥物制備系統(tǒng)的芯片中，用于合成反應的流道長度是固定的，越高的流速意味著更為短暫的反應時間，兩相形成層流進行成分交換、反應的時間也更為短暫，可以理解為用于包裹的脂質數(shù)量更少，導致粒徑更小。之所以稱為“部分依靠”，是因為再少的脂質，都有自組裝的趨勢，最終都需要形成穩(wěn)定的球狀結構，形成穩(wěn)態(tài)，因而對于固定的配方，在流速較小的時候提升流速，粒徑變化相對明顯，而流速越快，則粒徑變化越不明顯。

圖2：常規(guī)脂質體（liposome）在使用納米藥物制備系統(tǒng)時，通過調(diào)整總流速得到的不同粒徑結果[1]。

前后廢液：過多則浪費原料，過少則影響粒徑，需不斷摸索

前后廢液的形成，是因為納米藥物制備系統(tǒng)在運行初期，會有一段加速過程；運行終止前則又有一段減速過程。在速度變化期間，液體的流動速度不穩(wěn)定，導致粒徑持續(xù)變化，影響最終結果。為了保證最終成品的粒徑均一，就需要剔除這兩段液體。更大的廢液體積固然能夠保證粒徑均一，卻也使得原料浪費的比例更大。因而對于一個首次合成的配方，我們建議根據(jù)儀器說明書來設置。在說明書建議體積下合成后對廢液也進行粒徑測定，如粒徑也相對均一，則可以在下次實驗中酌情減少廢液，提升成品比例。

圖3：納米藥物制備系統(tǒng)中的廢液設置

參考資料：

[1] Andrew B., Anitha T., Mina O., et al.[R]Liposomes size tuning with formulation parameters, 2017

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