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  hhh0202008 2017-11-23 15:25:03

  掃描電子顯微鏡的設(shè)計思想和工作原理，早在1935年便已被提出來了。1942年，英國首先制成一臺實驗室用的掃描電鏡，但由于成像的分辨率很差，照相時間太長，所以實用價值不大。經(jīng)過各國科學(xué)工作者的努力，尤其是隨著電子工業(yè)技術(shù)水平的不斷發(fā)展，到 1956年開始生產(chǎn)商品掃描電鏡。近數(shù)十年來，掃描電鏡已廣泛地應(yīng)用在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、冶金學(xué)等學(xué)科的領(lǐng)域中，促進了各有關(guān)學(xué)科的發(fā)展。 一．掃描電鏡的特點 和光學(xué)顯微鏡及透射電鏡相比，掃描電鏡具有以下特點： (一) 能夠直接觀察樣品表面的結(jié)構(gòu)，樣品的尺寸可大至120mm×80mm×50mm。 (二) 樣品制備過程簡單，不用切成薄片。 (三) 樣品可以在樣品室中作三度空間的平移和旋轉(zhuǎn)，因此，可以從各種角度對樣品進行觀察。 (四) 景深大，圖象富有立體感。掃描電鏡的景深較光學(xué)顯微鏡大幾百倍，比透射電鏡大幾十倍。 (五) 圖象的放大范圍廣，分辨率也比較高?？煞糯笫畮妆兜綆资f倍，它基本上包括了從放大鏡、光學(xué)顯微鏡直到透射電鏡的放大范圍。分辨率介于光學(xué)顯微鏡與透射電鏡之間，可達3nm。 (六) 電子束對樣品的損傷與污染程度較小。 (七) 在觀察形貌的同時，還可利用從樣品發(fā)出的其他信號作微區(qū)成分分析。 二．掃描電鏡的結(jié)構(gòu)和工作原理 (一) 結(jié)構(gòu) 1．鏡筒 鏡筒包括電子槍、聚光鏡、物鏡及掃描系統(tǒng)。其作用是產(chǎn)生很細的電子束(直徑約幾個nm)，并且使該電子束在樣品表面掃描，同時激發(fā)出各種信號。 2．電子信號的收集與處理系統(tǒng) 在樣品室中，掃描電子束與樣品發(fā)生相互作用后產(chǎn)生多種信號，其中包括二次電子、背散射電子、X射線、吸收電子、俄歇(Auger)電子等。在上述信號中，Z主要的是二次電子，它是被入射電子所激發(fā)出來的樣品原子中的外層電子，產(chǎn)生于樣品表面以下幾nm至 幾十nm的區(qū)域，其產(chǎn)生率主要取決于樣品的形貌和成分。通常所說的掃描電鏡像指的就是二次電子像，它是研究樣品表面形貌的Z有用的電子信號。檢測二次電子的檢測器(圖15(2)的探頭是一個閃爍體，當(dāng)電子打到閃爍體上時，1就在其中產(chǎn)生光，這種光被光導(dǎo)管傳送到光電倍增管，光信號即被轉(zhuǎn)變成電流信號，再經(jīng)前置放大及視頻放大，電流信號轉(zhuǎn)變成電壓信號，Z后被送到顯像管的柵極。 3．電子信號的顯示與記錄系統(tǒng) 掃描電鏡的圖象顯示在陰極射線管(顯像管)上，并由照相機拍照記錄。顯像管有兩個，一個用來觀察，分辨率較低，是長余輝的管子；另一個用來照相記錄，分辨率較高，是短余輝的管子。 4．真空系統(tǒng)及電源系統(tǒng) 掃描電鏡的真空系統(tǒng)由機械泵與油擴散泵組成，其作用是使鏡筒內(nèi)達到 10(4～10(5托的真空度。電源系統(tǒng)供給各部件所需的特定的電源。 (二) 工作原理 從電子槍陰極發(fā)出的直徑20(m～30(m的電子束，受到陰陽極之間加速電壓的作用，射向鏡筒，經(jīng)過聚光鏡及物鏡的會聚作用，縮小成直徑約幾毫微米的電子探針。在物鏡上部的掃描線圈的作用下，電子探針在樣品表面作光柵狀掃描并且激發(fā)出多種電子信號。這些電子信號被相應(yīng)的檢測器檢測，經(jīng)過放大、轉(zhuǎn)換，變成電壓信號，Z后被送到顯像管的柵極上并且調(diào)制顯像管的亮度。顯像管中的電子束在熒光屏上也作光柵狀掃描，并且這種掃描運動與樣品表面的電子束的掃描運動嚴(yán)格同步，這樣即獲得襯度與所接收信號強度相對應(yīng)的掃描電子像，這種圖象反映了樣品表面的形貌特征。第二節(jié) 掃描電鏡生物樣品制備技術(shù)大多數(shù)生物樣品都含有水分，而且比較柔軟，因此，在進行掃描電鏡觀察前，要對樣品作相應(yīng)的處理。掃描電鏡樣品制備的主要要求是：盡可能使樣品的表面結(jié)構(gòu)保存好，沒 有變形和污染，樣品干燥并且有良好導(dǎo)電性能。 一．樣品的初步處理 (一) 取材 取材的基本要求和透射電鏡樣品制備相同，可參考第十四章超薄切片技術(shù)中所提的要求。但是，對掃描電鏡來說，樣品可以稍大些，面積可達8mm×8mm，厚度可達5mm。對于易卷曲的樣品如血管、胃腸道粘膜等，可固定在濾紙或卡片紙上，以充分暴露待觀察的組 織表面。 (二) 樣品的清洗 用掃描電鏡觀察的部位常常是樣品的表面，即組織的游離面。由于樣品取自活體組織，其表面常有血液、組織液或粘液附著，這會遮蓋樣品的表面結(jié)構(gòu)，影響觀察。因此，在樣品固定之前，要將這些附著物清洗干凈。清洗的方法有以下幾種： 1．用等滲的生理鹽水或緩沖液清洗； 2．用5%的蘇打水清洗； 3．用超聲震蕩或酶消化的方法進行處理。例如清洗腸粘膜表面的粘液，可用下面的方法： 清洗液配方：透明質(zhì)酸酶 300 (gα—糜蛋白酶 10 mg生理鹽水 100 ml清洗液的pH為5.5～6。清洗的方法是將樣品浸泡在配好的清洗液中，邊浸泡邊震蕩30分鐘，Z后用雙蒸水洗3次。無論用哪種清洗方法，注意在清洗時不要損傷樣品。 (三) 固定 固定所用的試劑和透射電鏡樣品制備相同，常用戊二醛及鋨酸雙固定。由于樣品體積較大，固定時間應(yīng)適當(dāng)延長。也可用快速冷凍固定。 (四) 脫水 樣品經(jīng)漂洗后用逐級濃度的酒精或丙酮脫水，然后進入中間液，一般用醋酸異戊酯作中間液。 二．樣品的干燥 掃描電鏡觀察樣品要求在高真空中進行。無論是水或脫水溶液，在高真空中都會產(chǎn)生劇烈地汽化，不僅影響真空度、污染樣品，還會破壞樣品的微細結(jié)構(gòu)。因此，樣品在用電鏡觀察之前必須進行干燥。干燥的方法有以下幾種： (一) 空氣干燥法 空氣干燥法又稱自然干燥法，就是將經(jīng)過脫水的樣品，讓其暴露在空氣中使脫水劑逐漸揮發(fā)干燥。這種方法的Z大優(yōu)點是簡便易行和節(jié)省時間；它的主要缺點是在干燥過程中，組織會由于脫水劑揮發(fā)時表面張力的作用而產(chǎn)生收縮變形。因此，該方法一般只適用 于表面較為堅硬的樣品。 (二) 臨界點干燥法 臨界點干燥法是利用物質(zhì)在臨界狀態(tài)時，其表面張力等于零的特性，使樣品的液體完全汽化，并以氣體方式排掉，來達到完全干燥的目的。這樣就可以避免表面張力的影響，較好地保存樣品的微細結(jié)構(gòu)。此法操作較為方便，所用的時間也不算長，一般約2～3小 時即可完成，所以是Z為常用的干燥方法。但用此法，需要特殊儀器設(shè)備。 臨界點干燥是在臨界點干燥儀中進行的，操作步驟如下： 1．固定、脫水：按常規(guī)方法進行。如樣品是用乙醇脫水的，在脫水至后，要用純丙酮置換15～20分鐘。 2．轉(zhuǎn)入中間液：由純丙酮轉(zhuǎn)入中間液醋酸異戊酯中，時間約15～30分鐘。 3．移至樣品室：將樣品從醋酸異戊酯中取出，放入樣品盒，然后移至臨界點干燥儀的樣品室內(nèi)，蓋上蓋并擰緊以防漏氣。 4．用液體二氧化碳置換醋酸異戊酯：在達到臨界狀態(tài)(31(C ， 72.8大氣壓)后，將溫度再升高10(C，使液體二氧化碳氣化，然后打開放氣閥門，逐漸排出氣體，樣品即完全干燥。 (三) 冷凍干燥法 冷凍干燥法是將經(jīng)過冷凍的樣品置于高真空中，通過升華除去樣品中的水分或脫水劑的過程。冷凍干燥的基礎(chǔ)是冰從樣品中升華，即水分從固態(tài)直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，不經(jīng)過中間的液態(tài)，不存在氣相和液相之間的表面張力對樣品的作用，從而減輕在干燥過程中對樣 品的損傷。冷凍干燥法有兩種，即含水樣品直接冷凍干燥和樣品脫水后冷凍干燥。 1．含水樣品直接冷凍干燥法 1.1 取材固定：按常規(guī)方法進行。 1.2 置于冷凍保護劑中：將樣品置于冷凍保護劑中浸泡數(shù)小時。常用的冷凍保護劑為10%～20%二甲基亞砜水溶液，或15%～40%甘油水溶液。 1.3 驟冷：將經(jīng)過保護劑處理的樣品迅速投入用液氮預(yù)冷至(150(C的氟利昂冷凍劑中，使樣品中的水分很快凍結(jié)。 1.4 干燥：將已凍結(jié)的樣品移到冷凍干燥器內(nèi)已預(yù)冷的樣品臺上，抽真空，經(jīng)幾小時或數(shù)天后，樣品即達到干燥。 本方法不需要脫水，避免了有機溶劑對樣品成分的抽提作用，不會使樣品收縮，也是較早使用的方法。但是，由于花費時間長，消耗液氮多，容易產(chǎn)生冰晶損傷，因此未被廣泛應(yīng)用。 2．樣品脫水后冷凍干燥 樣品用乙醇或丙酮脫水后過渡到某些易揮發(fā)的有機溶劑中，然后連同這些溶劑一起冷凍并在真空中升華而達到干燥。和前一種方法比較，本方法的優(yōu)點是不會產(chǎn)生冰晶損傷， 且干燥時間短。不足之處是有機溶劑對樣品成分有抽提作用，造成部分內(nèi)含物丟失。乙腈(acetonitrile)真空干燥法：這是一種利用乙腈在急速蒸發(fā)時會冷卻固化的性質(zhì)將樣品干燥的方法。其操作步驟如下： (1). 固定、水洗：按常規(guī)方法進行。 (2). 乙腈置換：使用50%?70%?80%?90%的乙腈水溶液置換，Z后用乙腈代替，每步驟15～20分鐘。 (3). 干燥：至純乙腈時，放入真空鍍膜臺抽真空，乙腈和樣品在真空中很快致冷而被凍結(jié)(凍結(jié)的溫度為(45(C)，變成冰狀固體。然后繼續(xù)抽真空，使凍結(jié)的乙腈升華，約需30分鐘，樣品即達干燥。 樣品干燥后要粘在樣品臺上。對于不鍍膜而直接觀察的樣品，必須用導(dǎo)電膠來粘固；對于要鍍膜的樣品，則可以用膠水或wan能膠來代替，微細的樣品如粉末、纖維等也可用雙面膠紙來粘貼。 三．樣品的導(dǎo)電處理 生物樣品經(jīng)過脫水、干燥處理后，其表面不帶電，導(dǎo)電性能也差。用掃描電鏡觀察時，當(dāng)入射電子束打到樣品上，會在樣品表面產(chǎn)生電荷的積累，形成充電和放電效應(yīng)，影響對圖象的觀察和拍照記錄。因此在觀察之前要進行導(dǎo)電處理，使樣品表面導(dǎo)電。常用的導(dǎo)電方法有以下幾種： (一) 金屬鍍膜法 金屬鍍膜法是采用特殊裝置將電阻率小的金屬，如金、鉑、鈀等蒸發(fā)后覆蓋在樣品表面的方法。樣品鍍以金屬膜后，不僅可以防止充電、放電效應(yīng)，還可以減少電子束對樣品的損傷作用，增加二次電子的產(chǎn)生率，獲得良好的圖象。 1．真空鍍膜法 真空鍍膜法是利用真空 膜儀進行的。其原理是在高真空狀態(tài)下把所要噴鍍的金屬加熱，當(dāng)加熱到熔點以上時，會蒸發(fā)成極細小的顆粒噴射到樣品上，在樣品表面形成一層金屬膜，使樣品導(dǎo)電。噴鍍用的金屬材料應(yīng)選擇熔點低、化學(xué)性能穩(wěn)定、在高溫下和鎢不起作用以及有高的二次電子產(chǎn)生率、膜本身沒有結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)在一般選用金或金和碳。為了獲得細的顆粒，有用鉑或用金—鈀、鉑—鈀合金的。金屬膜的厚度一般為10nm～20nm。真空鍍膜法所形成的膜，金屬顆粒較粗，膜不夠均勻，操作較復(fù)雜并且費時，目前已經(jīng)較少使用。 2．離子濺射鍍膜法 在低真空(0.1～0.01乇)狀態(tài)下，在陽極與陰極兩個電極之間加上幾百至上千伏的直流電壓時，電極之間會產(chǎn)生輝光放電。在放電的過程中，氣體分子被電離成帶正電的陽離子和帶負(fù)電的電子，并在電場的作用下，陽離子被加速跑向陰極，而電子被加速跑向陽極 。如果陰極用金屬作為電極(常稱靶極)，那么在陽離子沖擊其表面時，就會將其表面的金屬粒子打出，這種現(xiàn)象稱為濺射。此時被濺射的金屬粒子是中性，即不受電場的作用，而靠重力作用下落。如果將樣品置于下面，被濺射的金屬粒子就會落到樣品表面，形 成一層金屬膜，用這種方法給樣品表面鍍膜，稱為離子濺射鍍膜法，圖15(3顯示該法的原理。 圖15(3 離子濺射鍍膜法原理圖 和真空鍍膜法比較，離子濺射鍍膜法具有以下優(yōu)點：(1)由于從陰極上飛濺出來的金屬粒子的方向是不一致的，因而金屬粒子能夠進入到樣品表面的縫隙和凹陷處，使樣品表面均勻地鍍上一層金屬膜，對于表面凹凸不平的樣品，也能形成很好的金屬膜，且顆粒較 細。(2)受輻射熱影響較小，對樣品的損傷小。(3)消耗金屬少。(4)所需真空度低，節(jié)省時間。 (二) 組織導(dǎo)電法 用金屬鍍膜法使樣品表面導(dǎo)電，需要特殊的設(shè)備，操作比較復(fù)雜，同時對樣品有一定程度的損傷。為了克服這些不足，有人采用組織導(dǎo)電法(又稱導(dǎo)電染色法)，即利用某些金屬 溶液對生物樣品中的蛋白質(zhì)?脂類和醣類等成分的結(jié)合作用，使樣品表面離子化或產(chǎn)生導(dǎo)電性能好的金屬鹽類化合物，從而提高樣品耐受電子束轟擊的能力和導(dǎo)電率。 此法的基本處理過程是將經(jīng)過固定、清洗的樣品，用特殊的試劑處理后即可觀察。由于不經(jīng)過金屬鍍膜，所以不僅能節(jié)省時間，而且可以提高分辨率，還具有堅韌組織，加強固定效果的作用。 組織導(dǎo)電法主要有碘化鉀導(dǎo)電染色法、碘化鉀--醋酸鉛導(dǎo)電法、丹寧酸—鋨酸導(dǎo)電法等。比較常用的是丹寧酸—鋨酸導(dǎo)電法，其具體操作方法如下： (1)．樣品處理：按常規(guī)方法取材、清洗及用戊二醛固定。 (2)．導(dǎo)電染色：將樣品放入2%～4%丹寧酸溶液中浸泡。如果觀察表面結(jié)構(gòu)，浸泡時間為30分鐘；如果觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)，浸泡時間為8小時，即可過夜。在浸泡過程中，可更換一次溶液。 (3)．清洗及再固定：用磷酸緩沖液充分清洗，然后放入1%鋨酸中固定2～4小時，再用磷酸緩沖液清洗。 (4)．脫水和干燥：按常規(guī)方法。 (5)．掃描電鏡觀察。 四．幾種特殊的樣品制備技術(shù) (一) 細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)冷凍割斷法 1972年，日本學(xué)者田中敬一采用冷凍樹脂割斷法將細胞打開，用掃描電鏡觀察細胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。后來他又以二甲基亞砜代替樹脂進行冷凍割斷取得成功，該方法簡便，結(jié)構(gòu)清晰，已得到廣泛應(yīng)用。其操作方法如下： 1．取材和固定：為了使細胞結(jié)構(gòu)清晰，不被過多的血細胞污染，可在取材前用灌注法沖洗。即先將動物麻醉，經(jīng)腹主動脈注入生理鹽水或低分子量的右，切開下腔靜脈放血，至無血色為止。然后迅速取材，將樣品修成1mm×1mm×5mm大小，投入1%鋨酸溶液中固定1小時，用1/15M磷酸緩沖液 (pH7.4)清洗兩次，每次10分鐘。 2．二甲基亞 浸泡：將樣品依次放入25%、50%二甲基亞砜溶液中，各浸泡30分鐘。 3．割斷：用TF—1型冷凍割斷裝置進行割斷。然后將割斷后的樣品放到50%二甲基亞砜中，等融化后再用1/15M磷酸緩沖液浸洗，每次10分鐘，換液5次。 4．軟化及后固定：將樣品放入0.1%鋨酸中軟化，溫度20(C，時間48～72小時。然后用1% 八 固定1小時，雙蒸水浸洗1小時，換液幾次，需徹底清洗干凈。 5．導(dǎo)電染色：將樣品放入2%丹寧酸中2小時(或過夜)，以雙蒸水清洗1小時，換液幾次。再以1% 八 固定30～60分鐘，雙蒸水清洗1小時。 6．脫水、干燥及鍍膜：按常規(guī)方法進行。 (二) 鑄型技術(shù) 為了研究空腔臟器特別是血管系統(tǒng)復(fù)雜的立體分布，先向腔內(nèi)注射某種成形物質(zhì)，待該物硬化后再把組織腐蝕去掉，剩下的成形物即能顯示血管系統(tǒng)的立體分布，這種技術(shù)稱鑄型技術(shù)。如果是研究血管系統(tǒng)，稱為血管鑄型。用鑄型技術(shù)制作的標(biāo)本，經(jīng)過鍍膜后，就可進行掃描電鏡觀察。 常用的鑄型劑有甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯及其共聚物以及ABS等。ABS是一種樹脂，為丙烯晴、丁二烯和苯乙烯的三元共聚物，被認(rèn)為是比較理想的鑄型劑。下面簡單介紹用ABS制作血管鑄型標(biāo)本的方法： 1．灌流和注入鑄型劑 首先將準(zhǔn)備灌注的器官取下或保持自然位置，找到動脈，插入玻璃管或靜脈穿刺針，并以粗絲線結(jié)扎之，用普通流水或溫鹽水將血管中的血液沖洗干凈。然后灌注鑄型劑ABS丁酮溶液，濃度為5%～30%，注入的壓力為100mmHg。注入鑄型劑的臟器，可以放在50(C～60(C 的溫水中浸泡6小時左右，這樣既能保持臟器的原形，也有助于鑄型劑的硬化。 2．腐蝕和清洗 將標(biāo)本放入10%～20%氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液中腐蝕，也有放20%～30%鹽酸中腐蝕。時間一般為5～7天。若用稀鹽酸腐蝕，可加入5%～10%胃蛋白酶，腐蝕的效果更好。然后用流水將血管鑄型周圍被腐蝕的組織沖洗干凈，時間為24～72小時，沖洗的速度要慢。 3．顯微解剖和剝制鑄型 為了暴露和切取要觀察的部分，需要在解剖顯微鏡下進行。如果鑄型太硬，可將鑄型浸入酒精中，加溫至40～60(C，能使鑄型變軟，便于解剖和切取。 4．干燥和鍍膜 將切取的鑄型用蒸餾水洗干凈，用濾紙吸干后放37(C溫箱中30～60分鐘，Z后放干燥缸中保存。鍍膜可用真空噴鍍，也可用離子鍍膜，方法同前。鍍膜后就可用掃描電鏡觀察 。 (三) 鹽酸化學(xué)消化法 為了研究被觀察細胞的基底面及深層細胞表面，可采用鹽酸化學(xué)消化法制備樣品。 1．固定和清洗：同常規(guī)方法。 2．鹽酸消化：用8mol/L鹽酸消化和腐蝕，其溫度與時間根據(jù)不同組織而異。 3．清潔樣品：用2%～5%Tween20作用3小時，以清潔樣品和穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)。 4．脫水、干燥和鍍膜：按常規(guī)方法處理。 參考文獻 1．朱祖福，沈錦德，許志義，等：電子顯微鏡．diyi版，北京，機械工業(yè)出版社，198 4，203～231． 2．朱麗霞，程乃乾，高信曾：生物學(xué)中的電子顯微鏡技術(shù)，diyi版，北京，北京大學(xué)出 版社，1983，236～258． 3．張景強，樸英杰，蔡?；I，等：生物電子顯微技術(shù)，diyi版，廣州，中山大學(xué)出版社 ，1987，113～132． 7 4．田中敬一、永谷隆編著，李文鎮(zhèn)、應(yīng)國華等譯：圖解掃描電子顯微鏡—生物樣品制備 ，diyi版，北京，科學(xué)出版社，1984． 5．Osatake H，Tanaka K，Inoue T: An application of rapid freezing， freeze substitution(fixation for scanning electron microscopy. 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