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  fwjb4naio 2006-08-27 00:00:00

  DNA序列測(cè)定技術(shù)（雙脫氧末端終止法）使用須知 (張宏、李振甫) 一、背景介紹 目前Z常用的手工DNA序列測(cè)定技術(shù)，仍然是Sanger等(1977)提出的酶法，也稱(chēng)雙脫氧末端終止法。這種方法生成相互獨(dú)立的若干組帶放射性標(biāo)記的寡核苷酸，每組核苷酸都有共同的起點(diǎn)，卻隨機(jī)終止于一種(或多種)特定的殘基，形成一系列以某一特定核苷酸為末端的長(zhǎng)度，各不相同的寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長(zhǎng)度由這個(gè)特定堿基，在待測(cè)DNA片段上的位置所決定。然后通過(guò)高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)放射自顯影后，從放射自顯影膠片上，直接讀出待測(cè)DNA上的核苷酸順序。 高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，亦是DNA序列測(cè)定技術(shù)的重要基礎(chǔ)，可分離僅差一個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度達(dá)300-500個(gè)核苷酸的單鏈DNA分子。DNA序列測(cè)定的簡(jiǎn)便方法，為詳細(xì)分析大量基因組的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)，時(shí)至今日，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)氨基酸序列都是根據(jù)基因或cDNA的核苷酸序列推導(dǎo)出來(lái)的。 除傳統(tǒng)的雙脫氧鏈終止法外，自動(dòng)化測(cè)序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今DNA序列分析的主流。此外，新的測(cè)序方法亦在不斷出現(xiàn)，如上世紀(jì)90年代提出的雜交測(cè)序法等。 二、雙脫氧末端終止法測(cè)序步驟 (一)制備模板 有兩種類(lèi)型的DNA可以作為Sanger法測(cè)序的模板，即純化的單鏈DNA和經(jīng)熱變性或堿變性的雙鏈DNA。 1、單鏈DNA模板 在一般情況下，可將靶DNA片段克隆于M13mp載體中，從M13mp系列噬菌體顆粒中分離得到的單鏈DNA模板效果Z佳，只要細(xì)心掌握模板與引物的Z佳比例，有經(jīng)驗(yàn)的測(cè)序人員通過(guò)一次末端終止反應(yīng)，能讀取300-500個(gè)核苷酸序列。 2、經(jīng)熱變性或堿變性的雙鏈DNA模板 利用雙鏈質(zhì)粒模板測(cè)序，其中有兩個(gè)至關(guān)重要的因素，即模板的質(zhì)量和聚合酶的種類(lèi)。用小量制備的質(zhì)粒DNA來(lái)測(cè)定未知序列的DNA克隆，往往因?yàn)橛形廴径⒉豢扇?。高純度的質(zhì)粒Z好采用氯化銫-溴乙錠梯度平衡超速離心法制備。其次是應(yīng)采用高質(zhì)量的聚合酶。一次末端終止反應(yīng)亦可能讀出300核苷酸序列。 (二)引物 酶法測(cè)序反應(yīng)中都有一個(gè)與模板鏈特定序列互補(bǔ)的寡核苷酸作為DNA合成的引物。不管是單鏈DNA作模板，還是用變性雙鏈DNA作模板，都有通用引物可用，而不必另行設(shè)計(jì)與未知DNA序列互補(bǔ)的引物。通用引物可直接從廠(chǎng)商購(gòu)買(mǎi)。 （三）DNA測(cè)序酶 該酶是一種經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的T7噬菌體DNA聚合酶，是測(cè)定較長(zhǎng)DNA的shou選酶。市售的各種以該酶為基礎(chǔ)的測(cè)序試劑盒，效果甚佳。 (四)放射性標(biāo)記 傳統(tǒng)的DNA測(cè)序方法都采用α-32P-dNTP作為放射性標(biāo)記物，但由于32p發(fā)射的高能β射線(xiàn)，常會(huì)引起二個(gè)問(wèn)題：首先是放射自顯影圖譜條帶擴(kuò)散、分辨率低，限制了識(shí)讀序列的數(shù)量和準(zhǔn)確性；其次是32P衰變會(huì)導(dǎo)致DNA樣品分解，通常都應(yīng)在測(cè)序反應(yīng)后24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行電泳，否則無(wú)法獲得好的結(jié)果。 近年來(lái)α-35S-dNTP被廣泛采用，是由于35S產(chǎn)生較弱的射線(xiàn)，克服了32P的二大缺點(diǎn)。放射自顯影圖譜具有較高的分辨率和較低的本底，測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物可在-20℃保存一周，而分辨率并不下降。 （五）測(cè)序膠的準(zhǔn)備及電泳 1、硅化玻璃板 2、配置電泳試劑和緩沖液 3、凝膠液的配置 4、電泳 5、電泳后凝膠的處理 (六)DNA序列的識(shí)讀 DNA序列的識(shí)讀: ①在顯影前后一定要注意標(biāo)明模板名稱(chēng)、日期和測(cè)序人等，并標(biāo)明各套反應(yīng)位置；②識(shí)讀時(shí)從顯而易見(jiàn)的特征序列開(kāi)始，如連續(xù)的同聚核昔酸(如TTTTT、AAAAA)或交替出現(xiàn)的嘌呤和嘧啶(如GTGTGTGT)，一旦找到這種序列，便可較快地確定目的序列的位置。 三、注意事項(xiàng) 盡管核酸序列測(cè)定方法越來(lái)越成熟、簡(jiǎn)便并且可以自動(dòng)化，但事實(shí)上，對(duì)于一個(gè)片段較長(zhǎng)、序列未知的待測(cè)核酸而言，仍然是一件耗時(shí)且繁瑣的工作。對(duì)于一個(gè)待測(cè)DNA分子，要制定一個(gè)能夠簡(jiǎn)捷準(zhǔn)確的測(cè)定方案，一般可以從以下幾個(gè)方面考慮： 1、DNA片段大小。 2、背景資料：是否清楚DNA限制性酶切圖譜，是否有一段已知序列，是否具有重復(fù)序列等。 3、測(cè)序目的: ①測(cè)定未知序列；②確定重組DNA的方向與結(jié)構(gòu)；③對(duì)突變(如點(diǎn)突變)進(jìn)行定位和鑒定；④比較性研究，如比較同種病毒不同株系之間的基因差異。后3種測(cè)序目的稱(chēng)為確證性測(cè)序。 4、實(shí)驗(yàn)條件：如手工測(cè)序還是自動(dòng)化測(cè)序，合成引物費(fèi)用等。 由于單套測(cè)序反應(yīng)所能準(zhǔn)確測(cè)定的DNA序列Z長(zhǎng)一般僅300-400bp。因此，在進(jìn)行序列測(cè)定之前，必須首先考慮待測(cè)DNA分子的大小，其次是所要測(cè)定的序列范圍以及要求的序列精確程度等，再結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的條件選擇切實(shí)可行的克隆及測(cè)序方案。 DNA序列如何測(cè)定 一、常規(guī)DNA測(cè)序的原理 制作物理圖譜的過(guò)程是一個(gè)逐步精細(xì)的過(guò)程。diyi步把每條染色體分成平均長(zhǎng)度在400kb的長(zhǎng)片段，每段克隆到一個(gè)YAC上，所有YAC克隆都按照其在染色體上的實(shí)際位置進(jìn)行排序，我們就得到了一個(gè)能夠覆蓋整個(gè)染色體的YAC文庫(kù)。 把每一個(gè)YAC克隆攜帶的染色體片段經(jīng)部分酶切形成一系列有重疊區(qū)域的40kb左右的片段克隆到粘粒上，得到粘粒文庫(kù)。每個(gè)粘粒上的染色體片段再經(jīng)酶切形成4kb左右的片段克隆到測(cè)序?qū)Ｓ玫馁|(zhì)粒載體上。測(cè)序質(zhì)粒上攜帶的4kb的片段就可以用現(xiàn)在常規(guī)測(cè)序的方法進(jìn)行測(cè)序了。把所有質(zhì)粒克隆的DNA片段序列讀出，再按照各個(gè)片段在染色體上的實(shí)際位置進(jìn)行排列，Z后就可以得到染色體的全部核苷酸堿基對(duì)序列。染色體的DNA堿基序列是基因組物理圖譜的Z精細(xì)形式。 所謂“常規(guī)測(cè)序方法”的基本特點(diǎn)有兩個(gè)：diyi，把待測(cè)序的DNA分子進(jìn)行處理，得到每個(gè)只差1個(gè)核苷酸的一系列逐步縮短的DNA分子的混合物；第二，通過(guò)凝膠電泳把這些DNA分子分離開(kāi)來(lái)，形成階梯狀排列的條帶，然后逐個(gè)讀出DNA的堿基序列。 二、化學(xué)法測(cè)序 得到長(zhǎng)度只差一個(gè)堿基的DNA分子的方法主要有兩種。一種是用化學(xué)方法把待測(cè)序的DNA片段在每個(gè)堿基處切斷一次。這是由Maxam和Gilbert發(fā)明的方法。具體做法是把待測(cè)序的DNA分子成單鏈分子，其5’端用32p進(jìn)行放射性標(biāo)記。然后把這些單鏈DNA分于分成4份，每份用一種化學(xué)試劑處理DNA片段，每種試劑可使DNA分子在一種堿基的5’端的磷酸二酯鍵處發(fā)生斷裂。例如，試劑一可使單鏈DNA分子在A堿基處斷裂，試劑二可使單鏈DNA分子在T堿基處斷裂，依此類(lèi)推。把反應(yīng)條件控制好，使每個(gè)DNA分子只發(fā)生一次斷裂，這樣，我們就得到4種反應(yīng)產(chǎn)物，每種由在一種堿基處發(fā)生斷裂形成的DNA片段組成。 把這4種反應(yīng)產(chǎn)物用聚丙烯凝膠電泳進(jìn)行分離，兩個(gè)DNA片段只要相差1個(gè)堿基，就可以在這種凝膠中被分成兩個(gè)條帶。電泳完成后，用X光膠片進(jìn)行曝光，Z后得到一張由不同條帶組成的序列圖。從這張圖上就可以讀出待測(cè)DNA片段的堿基序列。5’端的diyi個(gè)堿基G讀不出來(lái)，可以通過(guò)測(cè)定互補(bǔ)鏈的序列測(cè)出這個(gè)堿基。 三、酸法測(cè)序與測(cè)序的自動(dòng)化 另外一種得到長(zhǎng)度只差一個(gè)堿基的DNA分子的方法是英國(guó)科學(xué)家桑格發(fā)明的，這種方法利用DNA聚合酶以待測(cè)序的DNA單鏈分子為模版合成互補(bǔ)的新鏈。在合成新鏈時(shí)，合成原料除了4種脫氧核糖核苷酸外還加入一種2’和3’位上的羥基都脫除的核苷酸。由于缺少3’羥基，當(dāng)這種核苷酸被結(jié)合到鏈上后，它的后面不能再結(jié)合其他核苷酸，鏈的合成就此終止。與化學(xué)法測(cè)序類(lèi)似，我們可以準(zhǔn)備4種反應(yīng)物，加入的核苷酸類(lèi)似物分別攜帶A，G，C，T堿基，每種反應(yīng)物里包含在一種堿基處終止鏈延伸的長(zhǎng)短不同的DNA片段。這些DNA片段也要用放射性標(biāo)記，經(jīng)過(guò)凝膠電泳和放射自顯影，得到DNA條帶圖譜，根據(jù)圖譜可以讀出DNA的堿基序列。 這種方法比化學(xué)法簡(jiǎn)單，條件易于控制。用4種不同的熒光化合物分別標(biāo)記4種反應(yīng)的產(chǎn)物，就可以做到把4種反應(yīng)物混合在一起進(jìn)行電泳，可以提高電泳分析的效率。這種方法利用現(xiàn)代精密儀器和機(jī)器人技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)DNA測(cè)序的高度自動(dòng)化。目前市場(chǎng)上已經(jīng)有各種型號(hào)的DNA自動(dòng)測(cè)序儀可供選購(gòu)。 根據(jù)Z新計(jì)劃，到2000年人類(lèi)基因組的“草稿”要出來(lái)。這個(gè)“草稿”包含了90％的人類(lèi)基因組的序列，每個(gè)區(qū)域測(cè)定5次左右。到2003年完整的人類(lèi)基因組序列測(cè)定可以完成，這個(gè)序列可以作為“參考基因組”或者“標(biāo)準(zhǔn)基因組”用于生物醫(yī)學(xué)研究。測(cè)定這個(gè)“標(biāo)準(zhǔn)基因組”所用的DNA是由10到20位志愿者提供的，用男性的精子DNA和女性的血液DNA作為樣品構(gòu)建了人的基因組文庫(kù)，因此，“標(biāo)準(zhǔn)基因組”序列不是哪一個(gè)具體的人的序列，而是幾十位志愿者的序列的綜合體現(xiàn)。 四、單分子熒光測(cè)序 單分于熒光測(cè)序是一種快速DNA測(cè)序法，這是利用單分子操作技術(shù)直接讀取DNA的堿基序列的方法，與傳統(tǒng)的熒光測(cè)序法相比，這種方法可大大提高速度。用桑格測(cè)序方法現(xiàn)在每天可以解讀上萬(wàn)個(gè)堿基序列，但是如果單分子熒光測(cè)序取得成功，它可以在兩分鐘內(nèi)完成傳統(tǒng)方法一天的工作。 單分于熒光測(cè)序的主要過(guò)程如下。diyi步，取一條大約有5萬(wàn)個(gè)堿基那么長(zhǎng)的單鏈DNA分子，把它的一端用化學(xué)方法連接在一個(gè)非常微小的塑料球上，DNA分子就會(huì)纏繞在塑料球上。第二步，在一張類(lèi)似激光唱片的圓盤(pán)上鋪一層很薄的液體薄膜，然后用激光光鉗把塑料球放在這張光盤(pán)的液體膜上進(jìn)行移動(dòng)，DNA分子就會(huì)在后面被拖著展開(kāi)，就好像一只船拖著一條繩子快速前進(jìn)，把繩子拉展一樣。第三步，讓拉展的的DNA分子與一種核酸外切酶結(jié)合。這種核酸外切酶可以和DNA的游離的末端結(jié)合，然后逐個(gè)把DNA的堿基切割下來(lái)。第四步，用單分子光譜技術(shù)逐個(gè)識(shí)別并且讀出堿基即達(dá)到了測(cè)序的目的。 目前，單分子熒光測(cè)序技術(shù)還沒(méi)有完全成熟。主要問(wèn)題是用于識(shí)別單個(gè)堿基的單分子光譜技術(shù)還沒(méi)有過(guò)關(guān)。利用隧道掃描顯微鏡和原子力顯微鏡直接讀取DNA分子堿基序列的研究也正在進(jìn)行之中，近期內(nèi)有可能取得突破。 五、DNA芯片與雜交測(cè)序 DNA芯片是一種通過(guò)雜交測(cè)定未知DNA序列的新技術(shù)。在一個(gè)玻璃或硅片上合成大量的寡聚核苷酸片段，例如可以合成8個(gè)堿基長(zhǎng)的全部可能的寡聚核苷酸片段（48＝65，536種）。這些探針一頭固定在固體基質(zhì)上，另外一端是游離的。它們?cè)诠杵嫌幸?guī)律地排列著，每個(gè)特定位置上探針的序列都是已知的。 假如有一個(gè)DNA片段需要測(cè)序，我們可以把它的單鏈形式用熒光進(jìn)行標(biāo)記，然后與硅片上的6萬(wàn)多種探針進(jìn)行分子雜交，在熒光顯微鏡下觀察雜交結(jié)果。如果某個(gè)探針與持測(cè)DNA的某個(gè)部分的序列是完全互補(bǔ)的，待測(cè)DNA分子就被結(jié)合到硅片上，這個(gè)探針?biāo)诘奈恢镁蜁?huì)發(fā)出熒光。這種包含大量的生物遺傳信息的寡聚核著酸陣列就叫DNA芯片，也叫基因芯片。 DNA芯片的制備要利用微電子芯片生產(chǎn)中的光刻技術(shù)以及在位組合化學(xué)技術(shù)。DNA芯片的閱讀要使用顯微術(shù)，信息的解讀要利用計(jì)算機(jī)技術(shù)。因此，DNA芯片是多學(xué)科交叉的產(chǎn)物。

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