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濕盒孵育法中如何盡量減少抗體使用

nancy子欲 2017-07-31 05:43:28 582  瀏覽
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  • 姚坤華 2017-08-01 00:00:00
    免疫熒光基本實(shí)驗(yàn)步驟 基本實(shí)驗(yàn)步驟: (1) 細(xì)胞準(zhǔn)備。對單層生長細(xì)胞,在傳代培養(yǎng)時(shí),將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片,PBS洗兩次;對懸浮生長細(xì)胞,取對數(shù)生長細(xì)胞,用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次,用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。 (2) 固定。根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。PBS洗滌3×5 min。 (3) 通透。使用交聯(lián)劑(如多聚甲醛)固定后的細(xì)胞,一般需要在加入抗體孵育前,對細(xì)胞進(jìn)行通透處理,以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時(shí)間一般在5-15min。通透后用PBS洗滌3×5 min。 (4) 封閉。使用封閉液對細(xì)胞進(jìn)行封閉,時(shí)間一般為30min。 (5) 一抗結(jié)合。室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次,每次沖洗5min。 (6) 二抗結(jié)合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h。PBST漂洗3次,每次沖洗5min后,再用蒸餾水漂洗一次。 (7) 封片及檢測。滴加封片劑一滴,封片,熒光顯微鏡檢查。 (一)細(xì)胞準(zhǔn)備 用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞可以是直接生長在蓋玻片上的貼壁細(xì)胞,也可以是經(jīng)過離心后涂片的懸浮細(xì)胞或者是將取自體內(nèi)的組織細(xì)胞懸液離心后涂片。貼壁良好的細(xì)胞一般在培養(yǎng)時(shí)直接放入coverslips讓細(xì)胞生長在其上即可,盡量避免使用貼壁性能不好的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn),以免后續(xù)的漂洗操作引起細(xì)胞脫落。少數(shù)實(shí)驗(yàn)需要使用這類細(xì)胞或者懸浮細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光觀察,建議使用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。 (二)固定和通透 除研究細(xì)胞表面抗原或不穩(wěn)定抗原可不固定外,一般均應(yīng)固定。固定的目的有三: ①防止細(xì)胞從玻片上脫落; ②除去防礙抗原-抗體結(jié)合的類脂; ③使標(biāo)本易于保存。 標(biāo)本的固定原則是: ①不能損傷細(xì)胞內(nèi)的抗原; ②不能凝集蛋白質(zhì); ③應(yīng)保持細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu); ④固定后應(yīng)保持通透性,以保證抗體自由進(jìn)入所有細(xì)胞與亞細(xì)胞組分與抗原結(jié)合。 常用的固定劑有多種,應(yīng)根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)和所使用的抗體特性選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌?。通常固定方法可以分為兩類:有機(jī)溶劑和交聯(lián)劑。有機(jī)溶劑如甲醇和丙酮等可去除類脂并使細(xì)胞脫水,同時(shí)將細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白沉淀。交聯(lián)劑如多聚甲醛通常通過自由氨基酸基團(tuán)形成分子間橋連,從而產(chǎn)生一種抗原相互連接的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。交聯(lián)劑比有機(jī)溶劑更易于保持細(xì)胞的結(jié)構(gòu),但因?yàn)榻宦?lián)阻礙抗體結(jié)合,可能會(huì)降低一些細(xì)胞組分的抗原性,因此需要增加一個(gè)通透步驟以使抗體能夠進(jìn)入標(biāo)本。兩種固定方法都可能使蛋白抗原變性,因此使用變性蛋白作為抗原生產(chǎn)的抗體在免疫熒光中可能更為有效。 Z常用的固定劑有多聚甲醛和甲醇,少數(shù)情況也使用乙醇,丙酮及戊二醛等進(jìn)行固定。通常,細(xì)胞結(jié)構(gòu)抗原、病毒及一些酶類抗原使用丙酮、乙醇及高濃度的甲醛固定可獲得較好的結(jié)果,而細(xì)胞膜相關(guān)組分抗原一般以多聚甲醛固定。細(xì)胞器和細(xì)胞顆粒內(nèi)的抗原一般也用多聚甲醛固定,并需要進(jìn)行通透以使抗體能達(dá)到抗原表位。 通透步驟只在檢測細(xì)胞內(nèi)抗原表位的時(shí)候才需要,因?yàn)榭贵w需要進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部去檢測蛋白。但是,如果待檢測的是跨膜蛋白,且其抗原表位處于胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域,則同樣需要對細(xì)胞進(jìn)行通透。相反,如果所檢測的抗原表位位于膜蛋白的胞外段,則不需要進(jìn)行通透。丙酮本身具有通透作用,因此用丙酮作為固定劑時(shí)是不需要通透的。甲醇同樣具有通透作用,但有些場合并不適合用甲醇,因?yàn)橐恍┍砦粚状挤浅C舾小3S玫耐ㄍ竸┦侨ス竸?,如Triton ,NP-40,以及Tween 20, Saponin, Digitonin 和 Leucoperm等。Triton和NP-40屬于烈性去垢劑,可部分溶解細(xì)胞核膜,因此非常適合核抗原檢測。但應(yīng)該注意的是,如果在高濃度下使用或者作用時(shí)間過長,它們將破壞蛋白,從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Triton X-100是Z常用的通透劑,但是它將破壞細(xì)胞膜,因此不適用于細(xì)胞膜相關(guān)抗原。后面一組去垢劑要溫和得多,它們可以在細(xì)胞質(zhì)膜上形成足夠大的孔隙以允許抗體通過,但是不會(huì)溶解細(xì)胞質(zhì)膜。適于胞質(zhì)抗原或者質(zhì)膜上靠近胞質(zhì)一面的抗原,也適于可溶性的核抗原。 一般的操作程序是先固定后通透,但針對有些水不溶性的目的抗原的檢測宜先通透再固定,這樣做的原因主要是可以通過通透去除許多水溶性的蛋白,從而大大減少了免疫熒光的背景和非特異性信號。固定后以冷PBS液漂洗,Z后以蒸餾水沖洗,防止自發(fā)性熒光。 (三)封閉 封閉的目的是為了減少抗體的非特異性結(jié)合,Z常用的封閉劑為1% BSA, PBS pH 7.5,其他可選擇的封閉劑還有 1% gelatin, 1%bovine 或與二抗種屬相同的血清(3-10%)等。 (四)抗體孵育 直接免疫熒光法中的一抗和間接免疫熒光法中的二抗都是熒光抗體,因此在這些抗體孵育的時(shí)候必須注意避光。此外,為保證結(jié)合質(zhì)量和防止干燥,抗體孵育應(yīng)盡量在濕盒中進(jìn)行。 (五)封片及熒光觀察  標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片原則上可以直接進(jìn)行觀察,特別是有時(shí)候封片不當(dāng)反而使得前功盡棄。但在絕大多數(shù)情況下,為了保存結(jié)果,以便進(jìn)一步觀察、照像、統(tǒng)計(jì)分析等,需作封片處理。常規(guī)的方法是采用甘油或中性樹脂封片,為了增強(qiáng)封片的效果,往往需要在封片時(shí)添加特殊的抗熒光淬滅劑。 (六)標(biāo)本保存 由于熒光色素和蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性都是相對的,因此隨著保存時(shí)間的延長,在各種條件影響下,標(biāo)記蛋白可能變性解離,失去其應(yīng)有的亮度和特異性。因此給標(biāo)本的保存帶來一定的困難,所以在標(biāo)本進(jìn)行熒光染色之后應(yīng)立即觀察。由于性能良好的抗熒光淬滅劑的出現(xiàn),熒光標(biāo)記的標(biāo)本可以在低溫(4℃或-20℃)下保存相當(dāng)長的時(shí)間。在某些情形下,考慮到實(shí)驗(yàn)的成本及實(shí)驗(yàn)條件,也可以采取權(quán)宜的辦法,比如固定標(biāo)本片后低溫保存,在需要時(shí)再進(jìn)行熒光標(biāo)記,即隨用隨染。

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壓汞法孔隙度測試分析技術(shù)是基于在精確控制的壓力下將汞壓入孔結(jié)構(gòu)中的方法實(shí)現(xiàn)的。除高速、精確及分析范圍廣等優(yōu)點(diǎn)外,壓汞儀還可得到樣品眾多特性,例如:孔徑分布、總孔體積、總孔比表面積、中值孔徑及樣品密度(堆積密度和骨架密度)。

孔隙度通常包括材料孔徑、孔體積、孔徑分布、密度和其他孔隙度相關(guān)特性的測量??紫抖葘τ诹私馕镔|(zhì)組成、結(jié)構(gòu)和應(yīng)用是非常重要的。材料的孔隙度影響其物理屬性從而影響其在周圍環(huán)境下的行為,影響材料的吸附性和滲透性、強(qiáng)度、密度和其他性質(zhì)。


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高智能化:依據(jù)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)定,自動(dòng)控制系統(tǒng)超過預(yù)設(shè)值,保持好預(yù)設(shè)值,超過對總體的操縱。

可信性高:為提升總體機(jī)器設(shè)備的可信性,關(guān)鍵構(gòu)件由各技術(shù)專業(yè)生產(chǎn)廠家出示。

省耗環(huán)保節(jié)能:與眾不同節(jié)能設(shè)計(jì)構(gòu)思,大幅度降低機(jī)器設(shè)備運(yùn)作花費(fèi)。

獨(dú)特設(shè)計(jì)構(gòu)思:可依據(jù)客戶規(guī)定做目的性設(shè)計(jì)構(gòu)思,滿足客戶需求要求。

操縱頁面:觸摸顯示屏五顏六色液晶顯尿屏電腦操作系統(tǒng)。

但是人們在操作流程中,留意某些小關(guān)鍵點(diǎn),也可以保證讓機(jī)器設(shè)備降低耗能,環(huán)保節(jié)能節(jié)電。

  • 1、恰當(dāng)放置機(jī)器設(shè)備

試驗(yàn)線要放到蔭涼自然通風(fēng)的自然環(huán)境,謹(jǐn)記防止太陽照射,機(jī)器設(shè)備的上下及背部都必須留出適度的室內(nèi)空間,便于熱管散熱,于環(huán)境試驗(yàn)箱周邊的工作溫度高將提升環(huán)境試驗(yàn)箱的用電量。

  • 2、定期維護(hù)密閉性

環(huán)境試驗(yàn)箱門的密封環(huán)立即危害到機(jī)器設(shè)備的密封性特性,假如密封膠條出現(xiàn)脆化、形變等狀況請立即拆換,不然就會(huì)危害關(guān)掉的緊閉水平,導(dǎo)致致冷或加溫泄露,進(jìn)而提升用電量。

  • 3、在多余的標(biāo)準(zhǔn)下嚴(yán)禁開啟尾門

每開啟多次尾門,就會(huì)有冷氣機(jī)或是熱流露出或泄露,那樣就務(wù)必得再運(yùn)行致冷或加溫系統(tǒng)軟件。假如必須必須開啟門,盡量姿勢要快,開關(guān)門視角盡可能小一點(diǎn)兒。

  • 4、按時(shí)清除塵土

制冷壓縮機(jī)和冷卻器的表層,每過四個(gè)月應(yīng)清除多次,塵土越大,熱管散熱實(shí)際效果越差,用電量進(jìn)而也就增大了。

除開恰當(dāng)實(shí)際操作實(shí)驗(yàn)室恒溫恒濕設(shè)備外,實(shí)際操作工作人員還需掌握機(jī)器設(shè)備的維護(hù)保養(yǎng)、清理及簡單常見故障的解決小常識。二者相輔相成不但能平穩(wěn)機(jī)器設(shè)備,在機(jī)器設(shè)備突發(fā)性常見故障時(shí),人們也不會(huì)不知所措了。

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Western孵育盒6分格,黑色,硅化處理
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  如何減少ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)中背景因素?

  ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)的原理在我們平時(shí)看來覺得很簡單,無非就是固定抗原,添加一抗、二抗和底物,間中夾雜著洗滌和閉。然而,即使是平常的洗滌和封閉,如果做得不太好,也有可能影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)。在做完實(shí)驗(yàn)時(shí),我們是否能獲得有用的信息,這在很大程度上取決于結(jié)果的信噪比。背景噪音會(huì)直接關(guān)系到結(jié)果的判斷。那么怎樣才能降低ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)中的背景因素呢,我們一起來了解。

  洗滌很重要

  洗滌步驟看似很無聊,其實(shí)很重要,因?yàn)槿绻唇Y(jié)合的材料(如非特異結(jié)合的抗體或檢測試劑)殘留在微孔板中,那么它會(huì)增加背景噪音。如有必要,可增加洗滌液中的鹽濃度,這會(huì)阻止非特異結(jié)合反應(yīng)。如果背景過高,而您懷疑洗滌不夠時(shí),可以嘗試增加洗滌次數(shù)。

  封閉更關(guān)鍵

  封閉液的作用是讓不相關(guān)的蛋白占據(jù)微孔板中潛在的結(jié)合位點(diǎn)。這就降低了可產(chǎn)生信號的抗體非特異結(jié)合的機(jī)會(huì)。您當(dāng)然也希望抗體只與目的蛋白結(jié)合吧。如果您的背景過高,懷疑封閉不充分,那么您可以嘗試使用更高濃度的封閉液,或適當(dāng)延長封閉時(shí)間。如果您一直被背景問題所困擾,那么也許您該花些時(shí)間來優(yōu)化封閉液。這可能需要時(shí)間,但也是值得的。目前主要有兩種類型的封閉液:蛋白和非離子型去污劑。您使用的類型須取決于多個(gè)因素,包括微孔板的表面試劑、吸附的抗原、您的抗體和檢測試劑。好的封閉液應(yīng)降低非特異性結(jié)合,但它不應(yīng)當(dāng)與抗原、抗體或檢測試劑發(fā)生相互作用。zui常用的非離子型去污劑是Tween-20。這種封閉液便宜、穩(wěn)定,在去除洗滌過程中的一些非特異結(jié)合上很有用。但它們只在存在時(shí)起作用,因?yàn)楹苋菀妆幌吹?。因此所有洗滌液中也必須添加封閉液。請勿使用高濃度(正常濃度為0.01-0.1%),它會(huì)降低特異結(jié)合,產(chǎn)生假陰性。另一個(gè)選擇是使用蛋白和非離子型去污劑這兩種封閉液,后者可協(xié)助洗滌過程中的封閉。蛋白封閉液則有所不同。它們與開放位點(diǎn)結(jié)合并封閉,同時(shí)穩(wěn)定與微孔板結(jié)合的抗原分子。常用的蛋白封閉液包括牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、正常血清和魚明膠。

  抗體濃度須優(yōu)化

  如果試劑稍有不同,則可能需要優(yōu)化抗體的量。記住,非特異的抗體結(jié)合會(huì)增加背景。為了防止這一點(diǎn),切勿使用過多的一抗或二抗。

  檢測試劑要適量

  另一點(diǎn)也很顯而易見:切勿使用過多的檢測試劑。如果濃度過高,或者未正確稀釋,則會(huì)導(dǎo)致高背景。也不要顯色過度,如有必要,優(yōu)化一下何時(shí)應(yīng)加入終止液。

  相信在注意這些細(xì)節(jié)后,我們就可以降低ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)中背景因素,才可以獲得我們想要的結(jié)果信息。

  本生(天津)健康科技有限公司由具有行業(yè)背景和豐富市場經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人士組成,于為生命科學(xué)研究領(lǐng)域提供產(chǎn)品,為廣大科研工作者提供服務(wù)。  既能滿足研發(fā)類客戶對產(chǎn)品種類、包裝的特殊要求,也能滿足生產(chǎn)型企業(yè)從小試、中試到規(guī)?;a(chǎn)各個(gè)階段的綜合需求。

  產(chǎn)品涵蓋有熒光定量PCR耗材(八聯(lián)管,單管,96孔板,384孔板,封板膜,輔助器等),ELISA試劑盒,移液器吸嘴,離心管,凍存管,培養(yǎng)皿,培養(yǎng)板,培養(yǎng)瓶,吸頭,儀器及手套,培養(yǎng)基,抗體,血清,色譜耗材,針頭過濾器及實(shí)驗(yàn)室常用耗材。  品種類超過萬種,廣泛應(yīng)用于科研院校、ZX實(shí)驗(yàn)室、分子生物學(xué)等科研領(lǐng)域。

  如何減少ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)中背景因素?本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命,追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承:遵紀(jì)守法,嚴(yán)于律己,寬仁以待,敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn),以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護(hù)和拓展市場,較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏,是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作,共創(chuàng)美好的未來。

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