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  609613349 2016-07-04 00:00:00

  E.Z.N.A. Total RNA Kit I 步驟 A． 真核細(xì)胞和組織 自己需要的材料： β－巰基乙醇、70％乙醇（DEPC水配置）、除RNase的槍頭和EP管。 材料的Z佳量 想得到Z佳的產(chǎn)量和好的Hibind RNA柱的純化效果，選用正確的細(xì)胞和組織量是Z重要的。Hibind RNA柱的Z大處理量是可變的，根據(jù)細(xì)胞和組織的類型。Z大的結(jié)合能力是100ug的RNA。TRK裂解緩沖液的Z大裂解能力是1*107個細(xì)胞或30mg的組織。 細(xì)胞的步驟 1． 用500ul的TRK裂解緩沖液裂解細(xì)胞（≤1*107），使細(xì)胞團(tuán)松散，輕輕彈EP管或者用槍頭吹旋，再用漩渦振蕩混勻。 a) 使用前每1ml TRK裂解緩沖液加入20ul的β－巰基乙醇。 b) 如果是單層的組織培養(yǎng)細(xì)胞（成纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞等），可以直接在細(xì)胞培養(yǎng)器里裂解細(xì)胞。完全吸去培養(yǎng)基后直接加TRK裂解緩沖液至細(xì)胞中。加700ul的TRK到T35細(xì)頸瓶或250px的培養(yǎng)皿中，更小的培養(yǎng)器加500ul的TRK。將液體布滿整個器皿表面，確保細(xì)胞裂解完全。將裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管中。 c) 如果細(xì)胞是懸液培養(yǎng)，收集細(xì)胞（≤1，500rpm or 400*g）*5min，棄上清，加入TRK裂解液，漩渦振蕩混勻，轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管中，進(jìn)行步驟2。 2． 勻漿化裂解產(chǎn)物 “裂解和勻漿化樣品”－第四頁有詳細(xì)的說明，如果細(xì)胞≤1*105，漩渦振蕩1min。不完全使樣品勻漿化會顯著的減少RNA的產(chǎn)量還容易造成柱子堵塞。 a) 用勻漿器30 s，使樣品勻漿化。 b) 用鈍的針頭的注射器（0.9mm直徑），至少吹打5次是樣品勻漿化。注射器要除RNase。 3． 將勻漿后的裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至Homogenization Spin Column中，離心，≥1，4000*g， 3min，室溫。將離心收集的流出液轉(zhuǎn)移到新的EP管中。轉(zhuǎn)到總RNA分離中第4步。 組織的步驟： 1． 用500ul的TRK裂解緩沖液裂解細(xì)胞（≤30mg），使用前每1ml TRK裂解緩沖液加入20ul的β－巰基乙醇。 500ulTRK裂解液Z大裂解能力30mg，難破碎的組織大于20mg就用700ul的TRK裂解液。當(dāng)組織量超出建議的Z大量時，也不要超過40mg。 組織樣品勻漿化參照第四頁選擇一種方法只用，除非是使用液氮， 2． 離心，≥1，5000*g， 5min， 室溫。 3． 轉(zhuǎn)移上清至，Homogenization Spin Column中，離心，≥1，3000*g， 3min，室溫。將離心收集的流出液轉(zhuǎn)移到新的EP管中。 總RNA分離： 4． 在裂解產(chǎn)物中加入50％體積（250ul－350ul）的無水乙醇（96％－100％）混勻，漩渦振蕩20s。 5． 樣品轉(zhuǎn)移到Hibind RNA Mini column上，離心管的Z大容量為750ul，加完乙醇后可能會形成沉淀。所以要充分振蕩將所有的混合液加入到柱子上。室溫離心，10，000*g，0.5-1min。棄去流出液（透過柱子流出到離心管里的液體）。 6． 將柱子放在一個新的2ml收集管中，加上300ul RNA wash buffer I。室溫離心，10，000*g， 0.5-1min。同樣棄掉流出液。 7． DNase I 消化（選擇性） 在我的實驗中沒有做這一步。 8． 將柱子再放到一個新的2ml收集管中，加入400ul RNA wash buffer I， 室溫離心，10，000*g， 30s，棄流出液。 9． 將柱子放到2ml收集管中，加入500ul RNA wash buffer II（乙醇稀釋過的），室溫離心，10，000*g， 30s，棄流出液。注意：使用前RNA wash buffer II 必須要用無水乙醇稀釋(48ml)，按照標(biāo)簽上的說明。 10． 用500ul RNA wash buffer II洗滌一次柱子，同上一步驟一樣。室溫離心，10，000*g， 30s，棄流出液。然后在空收集管中，以Z大轉(zhuǎn)速離心柱子，≥12，000*g， 2min， 室溫，使的HiBind 基質(zhì)完全干燥。 11． 轉(zhuǎn)移柱子到一個新的1.5ml的Ep管中，（試劑盒中沒有提供），加入50－100ul的DEPC水洗脫柱子（試劑盒中提供）。確保水直接加到了柱子的基質(zhì)上。10，000*， 1min， 室溫。如果RNA的總量大于30ug，可以進(jìn)行二次洗脫。 注意：可以選擇性地，用大一點的體積洗脫RNA。如果進(jìn)行二次洗脫，總RNA的量會增加，但是濃度會降低，因為80％以上的RNA會在diyi次時被回收。在加柱子前將水加熱到65℃并室溫孵育柱子5min會增加產(chǎn)量。

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