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  書山野樵 2010-10-26 00:00:00

  周質蛋白是在革蘭氏陰性菌中，其外膜與細胞間的狹窄膠質空間中存在的蛋白。它包括水解酶類、合成酶類呵運輸?shù)鞍椎取?/dd>

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  jiang1231997 2010-11-02 00:00:00

  體內藥物分析是通過分析的手段了解藥物在體內（包括實驗動物等機體）數(shù)量與質量的變化，獲得各種藥物代謝動力學的各種參數(shù)和轉變、代謝的方式、途徑等信息。從而有助于藥物生產、實驗、研究、臨床等各個方面對所研究的藥物作出估計與評價，以及對藥物的改進和發(fā)展作出貢獻。 體內藥物分析任務和對象的特點： 1、被測定的藥物和代謝物的濃度或活性極低； 2、樣品中存在各種直接或間接影響測定結果的物質，大多需要分離和凈化； 3、樣品量少，尤其是連續(xù)測定時，很難再度獲得完全相同的樣品； 4、工作量較大，隨著工作的深入開展，會成倍地甚或按指數(shù)級數(shù)增加； 5、往往要求很快地提供結果，尤其在毒物檢測工作中； 6、實驗室應有多種檢測手段，可進行多項分析工作； 7、測定數(shù)據的處理和闡明有時不太容易。 樣品的種類、采集和儲存 一、樣品的種類和選取原則： （一）血樣：血漿(plasma)和血清(serum)是體內藥物分析Z常采用的樣本，其中選用Z多的是血漿。因血漿中的藥濃可反映藥物在體內（靶器管）的狀況。而且血漿中藥物濃度的數(shù)據報道較多，可供借鑒。血漿是全血(whole blood)在加肝素、枸櫞酸、草酸鹽等抗凝劑的全血經離心后分取，量約為全血的一半。血清則是在血液中纖維蛋白元等影響下，引起析出血塊，離心取得。血塊凝結時往往易造成藥物吸附損失。全血也應加入抗凝劑混勻，以防凝血。對大多數(shù)藥物來說血漿濃度與紅細胞中的濃度成正比，所以測定全血也不能提供更多的數(shù)據，而全血的凈化較血漿與血清麻煩，尤其是溶血后，血色素等可能會給測定帶來影響。但是一些可與紅血球結合或藥物在血漿和血球的分配比率因不同病人而異的情況下，則宜采用全血。血樣采取量會受到一定的限制，血樣取樣時間間隔問題也常隨測定目的不同而異。目前大都是測定原型藥物總量。當藥物與血清蛋白結合率穩(wěn)定時，血藥總濃度可以有效表示游離藥物的濃度。但對低蛋白癥或尿毒癥患者，藥物結合率降低，則在通常安全有效的血藥總濃度中，游離型藥物濃度可顯著增加。 （二）尿樣(urine)：尿樣測定主要用于藥物劑量回收研究、藥物腎清除率和生物利用度等研究，以及測定代謝物類型等。體內藥物清除主要是通過尿液排出，藥物可以原型（母體藥物）或代謝物及其綴合物形式排出。尿液藥物濃度較高，收集量可以很大，但尿液濃度通常變化較大，所以宜測定一定時間內尿中藥物的總量（如8、12、24小時內的累計量），需記錄排出尿液體積及尿藥濃度。尿藥濃度改變不直接反映血藥濃度，受試者腎功能將影響藥物的排泄。尿中藥物大多呈綴合狀態(tài)，測定前要將綴合的藥物游離。此外，采集尿液不可能在較短時間內多次取樣，排尿時間較難掌握（尤其是嬰兒），同時也具有不易采集完全的缺點 。 （三）唾液(saliva)：唾液中的藥物濃度通常與血漿濃度相關。樣品易得，取樣無損害，尤易為兒童接收。有些可從藥物唾液濃度推定血漿中游離藥物濃度。但有些蛋白結合率較高的藥物在唾液中的濃度比血漿濃度低得多，需高靈敏度的方法才能檢測。唾液pH值6.9±0.5，每日分泌量1～1.5L，含有的主要電解質有Na+、K+、Cl-、HCO3 -等，主要有機成分是粘液質和淀粉酶。采樣一般是在漱口后15分鐘，收集口內自然流出或經舌在口內攪動后流出的混合唾液（吸管內吸附的少量唾液用稀釋液洗出），用2000～3000rpm離心15分鐘，小心吸取上清液，進一步分離、凈化。也可采用物理（嚼石蠟片、小塊聚四氟乙烯或玻璃大理石）或化學（酒石酸、維生素C）的方法刺激，在短時間內可得到大量唾液，但藥濃也可能會受到影響。 （四）其它：乳汁、動物臟器組織勻漿等。 二、樣品儲存和穩(wěn)定性考察：取樣后Z好立即進行分析，冷藏(4℃)、冰凍(-20℃)有時也不能完全保證樣品不起變化。尿液是很好的細菌生長液，若需收集24小時或更長時間的樣品或不能立即測定的，應置冰箱冷藏或加防腐劑（1%甲苯、過飽和氯仿）保存。分析樣品貯存時應考慮：儲存條件；樣品在貯存中會對分析結果產生什么影響；評述樣品穩(wěn)定性時會發(fā)生什么問題；如何預防或校正不穩(wěn)定樣品的分析結果。 測定前樣品的制備 除少數(shù)體液經簡單處理后直接測定外，通常在Z后一步測定前要采取適當?shù)臉悠分苽?，即進行分離、凈化、濃集、必要時尚需對待測組分進行化學改性，為測定創(chuàng)造良好條件。 一、樣品的制備要考慮：藥物的理化性質、待測物的濃度范圍、藥物測定的目的、選用的生物體液和組織的類型、樣品制備與分析技術的關系。 二、蛋白質的處理：是測定血漿、血清、全血及組織勻漿等樣品中藥物時的Z先處理步驟。 （一）加入沉淀劑和變性試劑：硫酸銨是經典的蛋白質沉淀劑，它與蛋白質分子競爭系統(tǒng)中水分子，而使蛋白質析出。陰離子型沉淀劑（三氯醋酸、高氯酸、鎢酸、焦磷酸）與帶電荷的蛋白質在氏于等電點的pH時形成不溶性鹽；反之，陽離子型沉淀劑（含鋅鹽、銅鹽）與蛋白質分子中帶陰電荷的羧基，在高于蛋白質等電點時，形成不溶性鹽。有關機制不十分清楚。 （二）加入可與水混合的有機溶劑：乙醇過量存在時，能使與蛋白結合狀態(tài)的藥物釋放可將混合物離心，取上清液（含藥），但這不能解決樣品的凈化問題。蛋白沉淀法對于與蛋白結合力強的藥物的回收率較差。也有采用酸消化法(Acid digestion)使藥物自蛋白結合處釋出，但常導致藥物的分解。 （三）組織的酶消化法： 蛋白水解酶(Proteolytic enzyme)中的枯草菌溶素(Subtilisin Carlsberg)不僅可使組織酶解，且可使藥物析出。優(yōu)點：1、因是在平穩(wěn)條件下進行的，可避免某些藥物在酸中水解及較高溫度時降解；2、可顯著改善對蛋白結合率強的藥物的回收率；3、可用有機溶劑直接提取消化液而無乳化生成的危險；4、在用HPLC時，無需再進行過多的凈化操作。缺點是不適用于一些在高pH時易水解的藥物。 三、提?。?（一）溶液的pH調節(jié)：Z佳pH選擇主要與藥物的pKa值有關。pH與pKa相當時，50%的藥物以非電離形式存在。堿性藥物Z佳pH值要高于pKa值1～2個pH單位；反之，則低1～2個單位?？墒?0%藥物以非電離開形式存在，易為溶劑提取。而對于堿性很強的藥物往往采用“離子對”技術進行提取和定量。體內酸性物質較多，在堿性條件下不會被萃取出來，故在pH值偏高的情況下進行提取較好。 （二）提取溶劑的極性：選好diyi個提取溶劑可減少以后的凈化操作，在液-液提取中多采用極性小的溶劑。加入少量醇類可克服極性小溶劑提取能力弱和減小藥物在容器表面的吸附損失的不足。也有利用不同極性的混合溶劑來提取藥物和凈化脂肪酸類。 （三）提取技術：由于體液樣品量少且藥物含量低，一次分析的樣品數(shù)量較多。與常量和微量分析相比，提取時通常不采用反復提取的方法，多半進行一次（至多二次）提取，在改變pH后，從有機相回提至水相也只進行一次。一般并不考慮“提盡藥物”，測定含量時則應精確加入提取溶劑，提取液也要定量分出。為避免進樣時帶來的誤差，多采用提取前加入等量內標，以待測組分峰高（或峰面積）與內標峰高（或峰面積）之比對濃度作標準曲線。這樣，即使在一系列操作過程中有微量損失，對比值影響也較小?；旌蠒r可在密塞情況下將試管平置于振蕩器內振蕩，振蕩時間與強度視情況而定?？刹捎靡浴八幬镛D入溶劑中量”與“混合時間”作圖法，選取理想和符合實際的提取方式和時間。 （四）提取溶劑的蒸發(fā)：提取液常為數(shù)ml，往往不能直接供GC或HPLC測定，需采取濃集辦法，常用真空蒸發(fā)（注意暴沸）或吹氮氣流使溶劑揮散。 四、固相分離：以固相分離方法進行樣品預處理，從水相中分離出所需測定的組份，通常以柱分離方式進行操作，故有時這種方法又稱為固相提取柱(Solid-phase extraction column)法。這類柱分兩類：一種是阻留全部樣品在柱上；一種則僅阻留藥物及其相關物質。常用于填充柱的固相分離物質有氧化鋁、活性碳、硅藻土、離子交換樹脂及非離子型的樹脂及凝膠等。在diyi類柱中，常使用親水性裝填物，如硅藻土，可捕集全部樣品。樣品全部吸附在固相顆粒表面，形成一薄層，即使樣品中含水也能如此。采用一種與水不相混溶的有機溶劑如氯乙烷傾入柱中，即可洗提藥物。第二類柱則較有選擇性，可裝填疏水物或離子交換樹脂，對藥物及其相關物質進行滯留。常用的疏水物有活性碳、聚苯乙烯或C18化學鍵合硅膠。這種疏水柱可從樣品中吸附親脂性藥物，然后用有機溶劑將藥物洗提分離。離子交換柱適用于高極性、可電離的藥物。 五、利用分子大小進行分離—供血漿中游離藥物的測定：采用超速離心、平衡透析、限外過濾（超濾）以及凝膠過濾方法等。以上方法也可用于藥物蛋白結合率的測定。

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