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問答社區(qū)

知道激光共聚焦顯微鏡的分辨率嗎?到底比普通顯微鏡高多少?

645505276 2014-12-15 13:42:49 966  瀏覽
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參與評(píng)論

全部評(píng)論(1條)

  • shansgshir775 2014-12-16 00:00:00
    真實(shí)色共焦顯微鏡與激光掃描共焦顯微鏡,二者在成像原理上基本是一樣的,Z大不同之處是照明光源不同。1、激光掃描共焦顯微鏡激光掃描共焦顯微鏡的照明光源是激光,即單色光。其實(shí)際成像過程是根據(jù)被觀察物體對(duì)該單色激光的反射光的強(qiáng)弱來(lái)成像的。由于是單色光照明,不能分辨顏色,對(duì)于在同一試樣的同一視場(chǎng)內(nèi),顏色不同,但對(duì)該單色激光反射光強(qiáng)度相同的不同組織或成分不能分辨。容易產(chǎn)生同相異色,同色異相的現(xiàn)象,不利于對(duì)微觀組織和成分的正確分辨。2、真實(shí)色共焦顯微鏡真實(shí)色共焦顯微鏡的光源是氙光源,即白光。其實(shí)際成像過程是在白光照明的條件下,對(duì)物體形貌(包括顏色)進(jìn)行綜合的成像。由于是多色光照明和成像,真實(shí)色共焦顯微鏡能夠更真實(shí)的反應(yīng)物體的顏色和形貌,避免了激光掃描共焦顯微鏡產(chǎn)生的同相異色,同色異相的現(xiàn)象發(fā)生,觀察者可以通過顏色,分辨和判斷試樣的成分和組織。在這方面,其分辨率遠(yuǎn)強(qiáng)于激光掃描共焦顯微鏡綜合分析:在有顏色差異的試樣的觀察條件下,真實(shí)色共焦顯微鏡避免了激光掃描共焦顯微鏡產(chǎn)生的同相異色,同色異相的現(xiàn)象發(fā)生,觀察者可以通過顏色,分辨和判斷試樣的成分和組織。在這種條件下,真實(shí)色共焦顯微鏡的分辨率高于激光掃描共焦顯微鏡。在單色試樣的觀察條件下,分辨率才接近各自的技術(shù)指標(biāo)。然而,在實(shí)際觀察的試樣中,絕大多數(shù)不同的組織和成分都是有顏色差異的。對(duì)應(yīng)于沒有顏色差異或顏色差異小的試樣,可以通過人為的染色(例如腐蝕處理),提高圖像的分辨能力。在這一方面,激光掃描共焦顯微鏡是無(wú)能為力的。另外,分辨率是在特定條件下所能達(dá)到的一項(xiàng)技術(shù)指標(biāo),當(dāng)在實(shí)際使用中,不滿足該技術(shù)條件時(shí)(實(shí)際是常常不能滿足),其分辨率是達(dá)不到所給出的數(shù)值。下圖是鎳鉻合金在普通單色激光共聚焦顯微鏡中的成像,以及使用真實(shí)色共聚焦顯微鏡所成圖像的對(duì)比,其中紅圈內(nèi)是不同的化合物摻雜,可以清楚看到用單色激光共聚焦顯微鏡所成的圖像,僅憑灰度是無(wú)法準(zhǔn)確反應(yīng)其中化合物摻雜的區(qū)別的,而真實(shí)色共聚焦卻可以清楚區(qū)分他們的不同。

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人眼的分辨率只有1/ 10mm, 那么比1/ 10mm 小的物體或比1/ 10mm 近的兩個(gè)微小物體的距離,人眼就無(wú)法分辨了。所以出現(xiàn)了從簡(jiǎn)單的宏觀放大鏡到微觀觀測(cè)的光學(xué)顯微鏡,繼而電子顯微鏡。顯微鏡的分辨率定義是指在標(biāo)本上能清楚分辨的兩個(gè)小點(diǎn)之間的Z小距離。其計(jì)算公式為:

D=0.61λ/NA

式中:D 為分辨率(um);λ 為光源波長(zhǎng)(um);NA 為物鏡的數(shù)值口徑(也稱鏡口率)。

由公式可得到,顯微鏡的分辨率決定于入射光源的波長(zhǎng)以及所匹配物鏡的數(shù)值孔徑。由此可知,提高光學(xué)顯微鏡的方法:

1、降低光源波長(zhǎng)。

可見光Z短波長(zhǎng)為390nm,若用此波長(zhǎng)的紫外光作為照明光源,可使光學(xué)顯微鏡的分辨率降低至0.2um。但是由于大多數(shù)普通材料的玻璃會(huì)大量吸收340nm以下波長(zhǎng)的光,紫外光經(jīng)過大量衰減無(wú)法形成清晰、明亮的圖像。因此不得不使用石英(可透過低達(dá)200nm的紫外光)、熒石(可透過低達(dá)185nm的紫外光)等價(jià)格昂貴的材料,并且紫外光顯微鏡不能用肉眼進(jìn)行觀察,甚至受觀測(cè)樣品的限制,再加上昂貴的造價(jià),所以這種提高顯微鏡分辨率的方式由于其自身的局限性而不受廣泛應(yīng)用。

2、增加物鏡的數(shù)值孔徑NA.

數(shù)值孔徑NA=n*sin(u)

式中,n為物鏡與標(biāo)本之間的介質(zhì)折射率;u為物鏡的二分之一孔徑角。因此,從光學(xué)設(shè)計(jì)上適當(dāng)采用較大的孔徑角,或者增大折射率成為Z常見的提高光學(xué)顯微鏡分辨率的方法。一般低倍物鏡如10X以下其介質(zhì)采用空氣,折射率為1,即干燥系物鏡;水浸介質(zhì)是蒸餾水,其折射率為1.33;油浸物鏡介質(zhì)是香柏油或其它透明油,其折射率一般在1.52 左右,接近透鏡和載玻片的折光率,如Olympus 的100X油鏡。水浸物鏡和油浸物鏡不僅放大倍數(shù)高而且由于使用高折射率的介質(zhì),從而提高物鏡的分辨率。


(來(lái)源:廣州市明美光電技術(shù)有限公司 )

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