文章：NLRP3 inflammasome activation drives tau pathology

       期刊：Nature volume 575, pages,669–673(2019)

       主要作者單位：

       1.Department of Neurodegenerative Diseases and Geriatric Psychiatry, University Hospital of Bonn, Bonn, Germany.

       2.German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), Bonn, Germany.

        研究摘要

        阿爾茨海默病是Z主要的老年癡呆疾病，其特點是斑塊狀淀粉樣蛋白-β的積累，神經(jīng)原纖維纏結(jié)中過度磷酸化的Tau的聚集，以及神經(jīng)炎癥，共同導致神經(jīng)變性和認知功能下降。NLRP3炎癥小體在激活小膠質(zhì)細胞內(nèi)聚集，導致caspase-1和下游白細胞介素-1β，切割，釋放和活性成熟。NLRP3炎癥小體已被證明是必不可少的。

       淀粉樣蛋白-β在小鼠模型疾病的發(fā)展和進展尚不清楚。在此，作者發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性小體功能的喪失，通過調(diào)節(jié)tau磷酸酶和激酶，降低tau磷酸化和和聚集。Tau激活NLRP3炎性小體，腦內(nèi)注射含纖維淀粉樣蛋白的腦勻漿，以NLRP3依賴的方式誘導tau病理。這些數(shù)據(jù)確定了小膠質(zhì)細胞和NLRP3炎性小體激活在阿爾茨海默病發(fā)病機制中的重要作用，并支持阿爾茨海默病的淀粉樣細胞學假說，表明神經(jīng)原纖維纏結(jié)發(fā)展為淀粉樣β誘導的小膠質(zhì)細胞激活的下游途徑。

炎性小體在神經(jīng)退行性疾病中作用示意圖

炎性小體活化及信號通路示意圖

       Jess檢測條件培養(yǎng)基中分泌性Caspase-1

       實驗方法

       For caspase-1 detection or collection of conditioned medium for neuronal experiments, 2 million microglia or 600,000 microglia per well were plated in a 6-well plate.caspase-1secretion by using a Jess system (ProteinSimple). Here, samples were run undiluted on a 12–230-kDa separation module according to the manufacturer’s instructions and detection was achieved by using a caspase-1 antibody (Adipogen) at 1:50. Data were analysed with Compass software version 4.0.0 (ProteinSimple).

       結(jié)果

        結(jié)果說明原文：Jess-based analysis of conditioned medium of LPS + tau wild-type-treated wild-type microglia stained for caspase-1. LPS/ATP-treated wild-type microglia served as positive control

       結(jié)果說明原文：Jess-based analysis of conditioned medium of primary wildtype,Asc–/– and Nlrp3–/– microglia primed with LPS and treated with the indicated forms of tau P301S. LPS/ATP-treated wild-type microglia served as positive control. Samples were stained for caspase-1.

（來源：ProteinSimple）

近日，由希望之城綜合癌癥ZX系統(tǒng)生物學系、波士頓達納法伯癌癥研究所、哈佛醫(yī)學院、加州大學舊金山分校檢驗醫(yī)學系、劍橋大學血液學系、匹茲堡大學藥物發(fā)現(xiàn)研究所及東芬蘭大學分子科學研究所等多ZX研究所，利用Milo，探討ZL急性B淋巴細胞白血?。˙-ALL）的新型抑癌機制，并在Nature（IF：42.778）上發(fā)表：Signalling input from divergent pathways subverts B cell transformation, Nature. 2020 Jul;583(7818):845-851.

--研究內(nèi)容--

細胞的惡性轉(zhuǎn)化通常涉及一些基因的病變，其綜合活性會導致癌癥。本研究分析了1,148例患者來源的急性B淋巴細胞白血?。˙-ALL）的樣本，發(fā)現(xiàn)單個基因的突變不會促進白血病的發(fā)生，除非它們在表征B細胞分化階段的單一致癌途徑。與主要致癌驅(qū)動因子不一致的突變則會激活不同的信號通路，從而直接破壞B細胞的轉(zhuǎn)化。B-ALL中的致癌病變通常模仿前B細胞階段的細胞因子受體（通過激活信號轉(zhuǎn)導蛋白STAT5）或更成熟細胞中的前B細胞受體中（通過激活蛋白激酶ERK）的信號傳導。STAT5和ERK激活性病變很常見，但二者僅在約3％的病例中同時發(fā)生。單細胞突變和磷酸化蛋白分析顯示致癌的STAT5和ERK激活與競爭性克隆分離。STAT5和ERK參與相反的生化和轉(zhuǎn)錄過程，且分別由轉(zhuǎn)錄因子MYC和BCL6調(diào)控。當不同的信號通路被重激活時，主要致癌驅(qū)動因子受到Y(jié)Z，從而逆轉(zhuǎn)了B細胞轉(zhuǎn)化。相反，不同途徑組分的缺失會加速白細胞生成。因此，不同信號通路的持久性成為了B細胞轉(zhuǎn)化的強大障礙，而在一個主要驅(qū)動因素上的趨同則促使了白血病發(fā)作。不同信號通路的藥理學重激活，可以與YZ主要致癌驅(qū)動因子產(chǎn)生協(xié)同作用。因此，差異信號通路的重新激活可以作為先前未被認可的策略來增強B-ALLZL反應(yīng)。

--Milo實驗方法--

實驗?zāi)康?

為了測試在同一細胞中是否同時發(fā)生STAT5和ERK雙通路激活的罕見情況

實驗條件：

細胞密度: 25萬個細胞/ml

試劑盒: K500

多細胞落空率<2%

沉降時間: 7-10 min

裂解時間: 10s

電泳分離時間: 60s

檢測靶點: STAT5 phosphorylation (Y694) and ERK phosphorylation (T202/Y204)，同一熒光通道，不同分子量大小進行區(qū)分

一抗孵育條件:1:15, 4度過夜

二抗孵育條件: 1:20,室溫1hr

定義“陽性孔”的方法: 內(nèi)參Histone H3和TOTO DNA staining

--實驗結(jié)論--

Milo檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，STAT5和ERK雙通路激活的概率為2%，與雙細胞落空率相當，故在同一個細胞中發(fā)生雙通路激活幾乎不可能，STAT5和ERK激活信號通路互不兼容。

結(jié)論：

未轉(zhuǎn)化的B細胞不斷與周圍的環(huán)境交換信息，這取決于參與幾種不同的信號途徑（例如細胞因子受體和BCR途徑）。因此，多種多樣的信號輸入反映了正常細胞與其環(huán)境的相互作用，而在一個ZX途徑上的融合則是B細胞轉(zhuǎn)化的標志。與主要致癌驅(qū)動因子不一致的趨異途徑的失活是B細胞轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵步驟。分歧和潛在沖突的信號通路的重新激活是B細胞惡性轉(zhuǎn)化的強大障礙。因此，從ZL的角度來看，有針對性的重新激活發(fā)散途徑以干擾主要的致癌驅(qū)動因子可能是擴大ZL反應(yīng)的一種有前途的策略。

       一些暴露在體表外的上皮組織腫瘤導致的癌癥，如口腔癌、口咽癌和食道癌，相較于其他組織癌癥更容易通過觀察和鑒別粘膜表面的可見變化進行篩查。但是根據(jù)美國國家癌癥研究所的數(shù)據(jù)顯示，只有29%的口腔癌和口咽癌和19%的食道癌是在癌癥早期發(fā)現(xiàn)的。對于非轉(zhuǎn)移性腫瘤，5年生存率分別為83.7%（口腔癌和口咽癌）和45.2%（食管癌）；而轉(zhuǎn)移性腫瘤的5年生存率則分別只有39.1%和4.8%。手術(shù)邊緣殘留腫瘤的存在也會產(chǎn)生負面影響，這說明：目前臨床的肉眼判斷結(jié)合活檢為基礎(chǔ)的組織病理學診斷還不能夠達到良好的早期診斷目的。

       早期發(fā)現(xiàn)腫瘤和術(shù)后檢查殘余腫瘤的準確性是直接關(guān)系到癌癥復發(fā)率和患者生存率的預(yù)后因素。美國紀念斯隆-凱特琳癌癥ZX的Thomas Reiner團隊利用DNA修復酶PARP1作為癌癥細胞的靶向高對比度標記物，結(jié)合OptiScan公司的ViewnVivo活體熒光內(nèi)窺式激光共聚焦成像技術(shù)，發(fā)明了一種快速、靈敏的活檢手段，應(yīng)用于早期上消化道上皮性腫瘤的手術(shù)邊緣評估。該項研究于2020年3月發(fā)表在《nature》子刊《biomedical engineering》上。

圖1. PARPi-FL應(yīng)用于新鮮組織的共聚焦顯微成像具有與組織切片同樣的清晰度

        PARPYZ劑奧拉帕尼是獲得FDA批準的藥物，PARPi-FL是該類YZ劑的熒光標記類似物，因其對PARP1具有高度的親和力和特異性，可作為PARP1的靶向顯像劑。PARPi-FL是一種細胞穿透成像劑，在沒有與機體內(nèi)細胞進行靶向結(jié)合的情況下可被快速代謝清除。與其他核染色活性染料相比，PARPi-FL不插入DNA，而是可逆地與PARP1結(jié)合，PARP1作用于DNA鏈斷裂，不具有致突變性。前人利用靜脈注射PARPi-FL后證明其可作用于全身和細胞水平上高對比度異種移植成像。并且，PARPi-FL的組織穿透性使其能夠替代靜脈注射作為局部藥物使用，應(yīng)用小劑量的PARPi FL即可立即成像。

圖2. PARP1作為腫瘤標志物具有很強的特異性和標志物信號強度

       與組織深層深層和上皮相比，腫瘤內(nèi)PARP1陽性區(qū)域明顯高于上皮（5.0%±1.9%，P = 0.03）和組織深層（0.9%±0.5%，P = 0.02）（圖2b）。利用viewnvivo從組織表面垂直斷層掃描的結(jié)果表面，深層的影像也可十分清晰捕捉（圖2c）

       Thomas團隊在對PARP1在食管癌中的表達研究中發(fā)現(xiàn)，包括腺癌和鱗狀細胞癌（T1-T3期）在內(nèi)的一些腫瘤組織，PARP1表達水平均高于正常上皮和粘膜下深層組織，表明正常組織和腫瘤組織之間存在明顯的定量差異。PARP1表達增加導致PARPi-FL攝取增加，這個增加的比例在腫瘤中高于正常組織20倍。研究人員對比了多個動物模型，發(fā)現(xiàn)PARP1表達比例Z低的是小鼠模型，但即使這樣，小鼠模型中PARP1在腫瘤中的PARPi-FL信號也比在正常食管中高出了6倍。這些數(shù)據(jù)表明，用上述方式在食管中進行高對比度無創(chuàng)內(nèi)鏡成像是可行的。

圖3. PARPi-FL共聚焦影像活檢在臨床上的應(yīng)用

       為了進行PARPi-FL的人體成像，讓經(jīng)組織病理學確診的口腔鱗狀細胞癌患者用含PARPi-FL的溶液漱口后，使用多光子成像技術(shù)拍攝熒光圖像。良性肉芽腫（藍圈）和腫瘤（黃圈）區(qū)域都有PARPi-FL積累，但是特異性的PARPi-FL僅在腫瘤中可檢測到。表明了相較于良心增生組織，腫瘤對于PARPi-FL具有很強的特異性，可以應(yīng)用于影像學提高癌癥檢出率。雖然使用PARPi-FL作為熒光造影劑還在臨床試驗中，但上述實驗可以證明使用漱口水的方法進行局部腫瘤活體評估已成為可能。

圖4. ViewnVivo活體熒光內(nèi)窺式激光共聚焦成像系統(tǒng)

       Z后，搭配ViewnVivo活體成像技術(shù)的PARPi-FL激光成像結(jié)果與免疫組化PARP1組織切片染色結(jié)果非常相似，活體成像Z快 1分鐘即可完成。一旦外科醫(yī)SF現(xiàn)陽性邊緣，可以立即進行再次切除和邊緣評估。在PARPi-FL共聚焦熒光成像后可保持新鮮組織完整，該組織可用于后續(xù)其他研究，如組織病理學、蛋白質(zhì)組學或基因組分析。

圖5. 操作簡便的ViewnVivo成像效果與光學顯微鏡下免疫組化染色結(jié)果相媲美

       相信不久以后，活體熒光內(nèi)窺式激光共聚焦成像技術(shù)診斷惡性腫瘤方法會普及應(yīng)用到早期鱗狀上皮癌癥的診斷，幫助外科醫(yī)生對手術(shù)進行評估，提高檢出率，減少患著痛苦。

       世界衛(wèi)生組織將所有類別的紫外線(ultraviolet, UV)輻射歸類為1級致癌物質(zhì)。然而，調(diào)查顯示，仍有80%的歐洲人相信擁有古銅色的肌膚象征著健康和美麗。但本質(zhì)上，曬黑就是紫外線對皮膚造成傷害的表現(xiàn)。同時，有證據(jù)表明紫外線可以預(yù)防心血管疾病和增強肝臟代謝。不論是利是害，陽光通過皮膚對大腦和內(nèi)分泌系統(tǒng)造成影響已是不爭的事實?，F(xiàn)在，又有研究發(fā)現(xiàn)，日光暴露會導致男性的覓食行為和食物攝入的增加，而雌激素的干擾則使得女性不受其影響。

    發(fā)表于nature metabolism的一項題為“Food-seeking behavior is triggered by skin ultraviolet exposure in males”的研究指出：UVB的照射將導致皮膚脂肪細胞中的p53轉(zhuǎn)錄激活，饑餓素（ghrelin）的mRNA水平升高，血漿中饑餓素濃度增加，從而增進進食***；在敲除了p53的小鼠中，UVB誘導下的饑餓素表達和覓食行為被消除；而在雌性中，雌激素則通過干擾饑餓素啟動子上的p53-染色質(zhì)相互作用，阻止了饑餓素對UVB的響應(yīng)。

    參與食欲調(diào)節(jié)的激素有很多，如胰島素、瘦素等外周激素都可食欲，但饑餓素是目前***已知能夠刺激食欲的外周肽。饑餓素的分泌受血液中營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物的抑制，而谷氨酸鈉、多巴胺、催產(chǎn)素和腎上腺素則會增加饑餓素分泌。多種環(huán)境因素，如音樂、光照、氣味，都能影響?zhàn)囸I素分泌，但潛在機制未明。胃是饑餓素的主要來源，然而切除胃只能減少65%的饑餓素，說明還存在著其他生產(chǎn)饑餓素的組織。本項研究揭示了UVB暴露-皮膚-p53基因-饑餓素這條通路是如何影響人類男性/雄性小鼠增加覓食行為，而人類女性/雌性小鼠則不受影響的。

日光照射可增強男性能量攝入和代謝情況

     研究人員通過分析一項約3000人為期3年的全國營養(yǎng)調(diào)查數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，男性的能量攝入和代謝情況與太陽輻射及其季節(jié)性波動顯著相關(guān)。研究對志愿者UVB暴露前后血漿進行質(zhì)譜分析，并通過蛋白質(zhì)圖譜和基因本體論分析進行功能相關(guān)性分析，對小鼠UVB暴露后總血漿蛋白進行蛋白質(zhì)組學分析。數(shù)據(jù)表明，和人類男性一樣，雄性小鼠對紫外線和季節(jié)變化更為敏感，新陳代謝受到顯著影響。

UVB暴露增強雄性的覓食行為

    研究人員對小鼠進行為期10周的UVB暴露處理，并觀測期間的食物攝入量和行為活動，發(fā)現(xiàn)雄性小鼠在暴露于UVB時，食物攝入量和進食行為顯著增加，但***大攝氧量和糞便中的脂肪含量則表明，基礎(chǔ)代謝率不會受到調(diào)節(jié)。通過經(jīng)典的衡量動物可以為獲得食物付出多少努力的樓梯測試，研究人員發(fā)現(xiàn)，經(jīng)UVB暴露的雄性小鼠比未經(jīng)UVB暴露的雄性小鼠吃得多得多。曠場測試的結(jié)果則顯示，經(jīng)UVB暴露的雄性小鼠吃下的食物數(shù)量和在***食物區(qū)域停留的時間都顯著增加。常用來測試動物焦慮行為的高架十字迷宮實驗及對小鼠注射β-內(nèi)啡肽拮抗劑納曲酮的曠場測試則表明，β-內(nèi)啡肽不是UVB暴露導致增強覓食行為的原因。

    DNA提取是分析農(nóng)作物分子生物學性狀的重要步驟，現(xiàn)階段，常用的DNA提取技術(shù)有磁珠法和離心柱法，使用磁珠進行農(nóng)作物的DNA提取，可以實現(xiàn)高通量、自動化的操作。由于磁珠對核酸的吸附靈敏度高，只需要少量的葉片或其他組織即可得到高得率、高純度的DNA。吉恩特生物采用自主研發(fā)生產(chǎn)的納米生物磁珠和磁珠法DNA提取試劑盒，可以從各種類型的農(nóng)作物中提取高質(zhì)量的核酸，配合核酸提取儀，可以達到快速自動化提取的目的。

       美國賓夕法尼亞州立大學的科學家們利用Ella在Cancer（IF：6.102）上發(fā)表文章：Dose-dependent effect of aerobic exercise on inflammatory biomarkers in a randomized controlled trial of women at high risk of breast cancer. Cancer. 2019 Sep30.

研究背景：

       炎癥水平升高與許多疾?。òò┌Y）密切相關(guān)。有研究報道，進行體育鍛煉可以降低患乳腺癌的風險以及降低其炎癥水平。本研究的目的是對絕經(jīng)前的婦女，進行了一項隨機對照試驗（WISER的一項姐妹試驗），研究了劑量性，中度至劇烈的有氧運動的干預(yù)，對處于罹患乳腺癌高風險的絕經(jīng)前婦女的炎癥水平的影響。

研究方法：

       將參與者隨機分為對照組（每周少于75分鐘；41例患者），低劑量運動（每周150分鐘；38例患者）或高劑量運動（每周300分鐘；37例患者）組。5個月經(jīng)周期-長時間的家庭跑步機的運動干預(yù)，以每周數(shù)分鐘的速度逐漸增加，強度Z高達到年齡預(yù)測的Z大心率的80％。在基線和隨訪時收集血液，并利用Ella分析炎癥因子CCL2，IL-10，IL-12和TNF-α的表達水平。

研究結(jié)果：

       促炎生物標記物CCL2呈線性劑量-反應(yīng)關(guān)系（對照組的％Δ為?5.44％，小劑量運動組為?0.03％，高劑量運動組為1.54％），IL-12（對照組的％Δ為-21.5％，小劑量運動組為38.2％，大劑量運動組為25.8％）和TNF-α（IL--12（對照組的％Δ為-4.69％，低劑量運動組為9.51％，高劑量運動組為15.7％）。但KY生物標志物IL-10則沒有呈現(xiàn)線性劑量-反應(yīng)關(guān)系（對照組的％Δ為5.05％，低劑量組為6.05％）劑量運動組，高劑量運動組為10.6％）。

研究結(jié)論：

       中度水平的有氧運動似乎以劑量依賴的方式增加了高患乳腺癌風險的健康女性人群中促炎生物標志物的水平。但目前的研究結(jié)果表明，健康的絕經(jīng)前婦女，對于增強體育活動可以降低乳腺癌風險的機制，可能與炎癥水平降低無關(guān)。

       本研究利用ProteinSimple的Ella對絕經(jīng)前婦女進行劑量性運動后的炎性因子Biomarker（CCL2，IL-10，IL-12和TNF-α）水平進行了檢測。

Ella的高靈敏度（pg/mL），高穩(wěn)定性（本文中的CV值均<8%），快速檢測（1小時出結(jié)果）以及自動化水平（消除人為操作誤差）為本研究提供了可靠數(shù)據(jù)。

原文：Intra-assay coefficient of variation (CV%) for each analyte was 3.2% for TNF-α, 7.2% for IL-12, 3.3% for CCL2, and 2.6% for IL-10.

（來源：ProteinSimple）