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1、引言

生物制藥制造涉及復(fù)雜的工藝步驟，嚴(yán)格的生產(chǎn)條件能最 大限度地提高生物產(chǎn)品的產(chǎn)量、純度和質(zhì)量。近年來(lái)，過(guò)程分析技術(shù)(PAT)越來(lái)越多地被用于實(shí)時(shí)監(jiān)控關(guān)鍵的過(guò)程和性能參數(shù)。PAT技術(shù)能更好地控制生產(chǎn)條件，工藝流體中的溶液濃度是許多生物處理步驟中實(shí)現(xiàn)成品質(zhì)量一致性所需的重要參數(shù)。

2、濃度測(cè)量的關(guān)鍵需求

許多生物制藥制造工藝步驟需要測(cè)量溶液中溶質(zhì)的濃度。對(duì)于上游過(guò)程，進(jìn)料和生物反應(yīng)器中成分的濃度對(duì)于細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)非常重要，同時(shí)要確?？芍貜?fù)操作；在下游過(guò)程中，需要大量的溶液(包括緩沖液)來(lái)進(jìn)行層析和超濾/透析(UF/DF)步驟。制備不當(dāng)?shù)娜芤嚎赡軙?huì)對(duì)下游過(guò)程產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面影響(例如，產(chǎn)品無(wú)法與色譜柱結(jié)合或不正確地配制原料藥)。

因此，溶質(zhì)濃度的測(cè)量是溶液制備過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵步驟，確保溶液在引入過(guò)程之前已經(jīng)被正確地配制。此外，在色譜運(yùn)行期間，通過(guò)對(duì)溶液進(jìn)行在線監(jiān)測(cè)，可以提供用于生成鹽梯度的輸入控制參數(shù)，進(jìn)行在線稀釋緩沖液，并監(jiān)測(cè)在色譜運(yùn)行的每個(gè)步驟(例如平衡、洗滌和洗脫)中是否使用了正確的溶液。

工藝過(guò)程中流體濃度的測(cè)量在清潔操作中十分重要，對(duì)清潔液進(jìn)行濃度測(cè)量以確定清潔溶液中酸、堿或清潔劑濃度是否處于適當(dāng)水平。未進(jìn)行該測(cè)量可能會(huì)導(dǎo)致清潔不充分、系統(tǒng)組件損壞以及系統(tǒng)停機(jī)時(shí)間延長(zhǎng)。濃度測(cè)量還用于監(jiān)測(cè)清潔過(guò)程所需要沖洗系統(tǒng)的水中的溶質(zhì)濃度，可以檢測(cè)清洗過(guò)程中清潔劑是否完全去除。

3、濃度測(cè)量技術(shù)概覽

要讓生物制藥制造商完全相信上游和下游生產(chǎn)過(guò)程中使用和產(chǎn)生的工藝流體是符合規(guī)定的濃度，擁有易于使用、有效且高效的濃度測(cè)量方法非常重要。理想的技術(shù)必須是可靠的，并且提供高精度和可重復(fù)性以及快速響應(yīng)時(shí)間。

電導(dǎo)率

電導(dǎo)率是衡量溶液傳導(dǎo)電流能力的指標(biāo)(1)。它可以通過(guò)在電極之間施加電壓，測(cè)量產(chǎn)生的電流，并確定溶液的電阻率(由此計(jì)算電導(dǎo)率)來(lái)測(cè)量。溶質(zhì)在溶液中導(dǎo)電的程度取決于其離子特性和濃度。因此，測(cè)量電導(dǎo)率是確定離子溶液濃度的好方法。

但是這種方法在測(cè)量含有非離子和弱離子物質(zhì)的溶液濃度的能力方面受到一定限制，包括許多生物處理溶液中的成分。使用電導(dǎo)率來(lái)精確測(cè)定許多生物制藥溶液中成分的濃度相對(duì)困難。

pH

溶液的pH值是衡量溶液酸度或堿度的指標(biāo)。具體來(lái)說(shuō)，pH值測(cè)量水合氫離子的濃度(2)。因此，它是解離時(shí)產(chǎn)生水合氫離子的物質(zhì)的水溶液濃度的有效指標(biāo)。

但對(duì)于不產(chǎn)生水合氫離子的工藝流體，它的用途有限。

滲透壓

滲透壓是一種基于由于給定溶質(zhì)(3)的存在而導(dǎo)致的溶液凝固點(diǎn)變化(或凝固點(diǎn)降低)的濃度測(cè)量方法。溶質(zhì)使溶液的凝固點(diǎn)降低到比純?nèi)軇┑哪厅c(diǎn)低的值。

一般情況下，溶質(zhì)濃度越大，凝固點(diǎn)降低越大;因此，濃度的大小與抑 制程度相關(guān)。與電導(dǎo)率和pH值通常用作在線技術(shù)不同，滲透壓是一種離線測(cè)量技術(shù)，不能提供實(shí)時(shí)信息。

折射率

折射率:當(dāng)光線從一種介質(zhì)進(jìn)入另一種介質(zhì)時(shí)，由于光在每種介質(zhì)中傳播速度的變化，光線會(huì)彎曲成一定角度。一種介質(zhì)的折射率(IoR)是真空中的光速與該介質(zhì)中的光速之間的比率(4)。不同濃度的溶質(zhì)溶液具有不同的折射率。因此，確定溶液的IoR可以直接測(cè)量溶液的濃度。

在傳統(tǒng)的折射計(jì)中，光源照射在樣品上，然后光線穿過(guò)溶液。這樣，分析人員就可以確定光的傳輸。然而，使用這種方法的結(jié)果可能會(huì)受到溶液中的濁度以及光的衍射和吸收的影響(1)。

一種較新的使用發(fā)光二極管(LED)反射IoR技術(shù)。來(lái)自LED的光線照射到光學(xué)窗口上，該光學(xué)窗口與待分析的工藝流體或產(chǎn)品溶液接觸。光在臨界角(θc)反射出光學(xué)窗口，在那里它被折射到流體。這個(gè)角度可以通過(guò)使用光電二極管陣列探測(cè)器分析反射光來(lái)確定。臨界點(diǎn)取決于溶液濃度。因此，分析人員可以迅速檢測(cè)到濃度的變化。使用這種方法測(cè)試的結(jié)果不受溶液濁度或衍射和光吸收的影響。

與電導(dǎo)率和pH值不同，溶液的折射率與它的電荷情況或酸性無(wú)關(guān)。由于該技術(shù)可以非?？焖俚卮_定溶液的IoR，所以適用于實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)的在線分析，可以對(duì)工藝變化立即做出響應(yīng)。此外，IoR監(jiān)測(cè)很容易從實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)展到商業(yè)生產(chǎn)，而不會(huì)對(duì)精度有所損傷。這使得該技術(shù)適用于需要濃度監(jiān)測(cè)的生物制藥應(yīng)用。

4、研究目的、材料和方法

這項(xiàng)研究的主要目的是比較電導(dǎo)率、IoR和滲透壓的性能，以測(cè)量生物制藥生產(chǎn)中經(jīng)常使用的不同類(lèi)型溶液的濃度。北卡羅來(lái)納州立大學(xué)的生物制造培訓(xùn)與教育中心(BTEC)進(jìn)行了這項(xiàng)分析技術(shù)評(píng)估。

為了評(píng)估，我們準(zhǔn)備了幾種生物制藥加工中常用的不同水溶液(表1)。我們測(cè)量了每種溶液的電導(dǎo)率、IoR和滲透壓。我們選擇的溶液包括一系列不同濃度的含有不同溶質(zhì)的液體。這些溶質(zhì)可分為離子型、非離子型和有機(jī)緩沖液。我們?cè)谏镏扑庍^(guò)程中可能使用的pH值條件下制備有機(jī)緩沖溶液，不需要調(diào)整pH值。

對(duì)于每種溶液，我們分別使用220型電導(dǎo)率儀(Denver Instruments)、BT128型IoR濃度監(jiān)測(cè)儀(Entegris)和3320型微滲透儀(Advanced Instruments)測(cè)量電導(dǎo)率、折射率和滲透壓。我們繪制了每種測(cè)試方法(電導(dǎo)率，IoR和滲透壓)對(duì)每種溶液濃度的響應(yīng)。線性響應(yīng)是一個(gè)重要的方法屬性，因?yàn)樗试S簡(jiǎn)單地量化溶液濃度。因此，我們使用響應(yīng)的線性度來(lái)評(píng)估方法的有效性。

5、結(jié)果與討論

我們將在下面討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

離子濃度

圖1：NaCl：電導(dǎo)率和折射率性能

圖2：NaCl：滲透壓和折射率性能

表1：進(jìn)行濃度分析的溶液

圖1和圖2顯示了NaCl溶液在0.1M到2 M濃度范圍內(nèi)的結(jié)果，每種方法都給出了合理的線性響應(yīng)。但是，由于樣品的凝固點(diǎn)過(guò)低(超出了本研究所用的滲透計(jì)的測(cè)量范圍)，高濃度NaCl(2M)溶液的滲透壓無(wú)法測(cè)定。

我們對(duì)氫氧化鈉溶液進(jìn)行了類(lèi)似的測(cè)量(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，與NaCl的結(jié)果一樣，NaOH(2 M)的最 高濃度的滲透壓超出了滲透計(jì)的范圍。此外，2M NaOH的電導(dǎo)率也超出了量程(300 mS/cm)的范圍。因此，無(wú)論是電導(dǎo)率還是滲透性都無(wú)法提供所研究的濃度范圍內(nèi)的讀數(shù)。相比之下，IoR在整個(gè)濃度范圍內(nèi)呈線性響應(yīng)。

非離子溶液

圖3：乙醇：電導(dǎo)率和折射率性能

圖4：乙醇：滲透壓和折射率性能

圖3和圖4顯示了乙醇溶液的電導(dǎo)率、IoR和滲透壓測(cè)量。沒(méi)有一種檢測(cè)方法在研究的濃度范圍內(nèi)(10-75v/v)提供完全線性響應(yīng)。然而，IoR方法提供了三種測(cè)試方法中最 好的結(jié)果。正如預(yù)期的那樣，乙醇溶液的電導(dǎo)率值相當(dāng)?shù)?，與濃度不是線性相關(guān)。當(dāng)酒精濃度≥0.25 v/v時(shí)，溶液不結(jié)冰。所以我們無(wú)法確定它們的滲透壓。與離子溶液一樣，IoR在整個(gè)濃度范圍內(nèi)具有最 佳的線性響應(yīng)。

對(duì)聚山梨酯80溶液的測(cè)量結(jié)果與乙醇溶液相似。在0.5-5v/v濃度范圍內(nèi)，聚山梨酸酯80溶液的IoR和滲透壓測(cè)量值呈線性(數(shù)據(jù)未顯示)。與乙醇的結(jié)果不同，聚山梨酸酯80的電導(dǎo)率和濃度的圖根據(jù)線性最 小二乘擬合的決定值系數(shù)顯示出一定的線性。由于聚山梨酯80是非離子型的，這個(gè)結(jié)果是出乎意料的。然而，測(cè)量的電導(dǎo)率值較低(均為5μS/cm以下)，在這個(gè)低范圍內(nèi)的測(cè)量精度相當(dāng)?shù)汀?/p>

有機(jī)緩沖液

圖5：Tris 無(wú) pH調(diào)節(jié)：電導(dǎo)率和折射率性能

圖6：Tris 無(wú) pH調(diào)節(jié)：滲透壓和折射率性能

圖7：Tris pH值8：電導(dǎo)率和折射率性能

圖8：Tris pH值8：滲透壓和折射率性能

在不同的pH值下，3種有機(jī)緩沖液(2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)、2-氨基-2-羥甲基丙烷-1，3-二醇(Tris)和2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES))的測(cè)定結(jié)果相似。圖5-8顯示了未調(diào)整和調(diào)整到pH 8的Tris溶液的數(shù)據(jù)。在10-500 mM的濃度范圍內(nèi)，pH為8的Tris溶液對(duì)所有測(cè)量方法都呈線性響應(yīng)。值得注意的是，在沒(méi)有調(diào)整pH的情況下，電導(dǎo)率和濃度之間的關(guān)系不是線性的。這些有機(jī)緩沖液只是弱離子的，在低電導(dǎo)值時(shí)，準(zhǔn)確度和精密度會(huì)受到影響。用酸調(diào)節(jié)pH到8，此時(shí)的Tris溶液的電導(dǎo)率數(shù)據(jù)與濃度呈線性關(guān)系，這是由于調(diào)節(jié)pH用的酸的關(guān)系（HCl）

表2：本研究中獲得的折射率、電導(dǎo)率和滲透壓數(shù)據(jù)的決定系數(shù)

表2總結(jié)了所使用的每種分析方法的決定系數(shù)(R2)。R2是數(shù)據(jù)與擬合線性回歸線的接近程度的統(tǒng)計(jì)度量(5)。該表清楚地表明，電導(dǎo)率是確定離子溶液和有機(jī)緩沖液濃度的合適方法。然而，這不是一種適合于測(cè)定非離子溶液濃度的方法。

表2中的結(jié)果還表明，雖然滲透壓適用于本研究評(píng)估的大多數(shù)溶液，但由于缺乏凍結(jié)，較高的溶質(zhì)濃度可能導(dǎo)致滲透壓值不確定。還應(yīng)該注意的是，滲透壓是一種離線方法，不能用于在線分析。值得注意的是，表2表明，在所有濃度下，只有IoR對(duì)所有溶液都有線性響應(yīng)。

我們觀察到所有方法都有良好的精度，盡管導(dǎo)電性能測(cè)試的重復(fù)性略低于IoR和滲透性測(cè)試，特別是在低導(dǎo)電性能值時(shí)。具體來(lái)說(shuō)，電導(dǎo)率測(cè)量需要頻繁校準(zhǔn)，讀數(shù)穩(wěn)定需要時(shí)間。

6、有效的濃度測(cè)量與IoR法

生物制藥生產(chǎn)中的質(zhì)量控制是生產(chǎn)安全有效的生物藥物的關(guān)鍵。生物制藥生產(chǎn)中使用的工藝流體的準(zhǔn)確濃度測(cè)量對(duì)于確保一致的加工，產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量至關(guān)重要。在線PAT方法的開(kāi)發(fā)提高了公司實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和控制生物過(guò)程的能力。

對(duì)于濃度測(cè)量，本研究表明IoR技術(shù)優(yōu)于傳統(tǒng)的濃度測(cè)量方法，如電導(dǎo)率和滲透壓。IoR方法對(duì)所有測(cè)試溶液的濃度都產(chǎn)生了優(yōu)秀的線性相關(guān)性。由于IoR能夠?qū)ι镏扑幧a(chǎn)中常用的許多不同類(lèi)型的試劑在更寬的濃度范圍內(nèi)進(jìn)行有效的實(shí)時(shí)濃度測(cè)量，具有很高的準(zhǔn)確度和精度，因此，它在實(shí)時(shí)在線測(cè)量工藝流體濃度方面具有很大的潛力。

凈化工作臺(tái)自凈時(shí)間一般多長(zhǎng)？