便攜式頻譜分析儀由于具有功能豐富，性能優(yōu)良、體積小巧，重量輕便，易于攜帶和操作等優(yōu)點(diǎn)，所以成為無線電干擾探測和分析，尤其是進(jìn)行現(xiàn)場的干擾排查和跟蹤定位應(yīng)用時的常用選擇。為了充分發(fā)揮設(shè)備的Z佳性能，需要根據(jù)具體的使用環(huán)境和使用場合對設(shè)備進(jìn)行合適的操作。下面以羅德施瓦茨公司的便攜式頻譜分析FSH為例。說明排查無線電干擾時的優(yōu)化設(shè)置和使用技巧。

通用操作技巧

1) 開始時為獲得Z大掃描速度，可使用粗分辨率的寬帶全掃寬掃描，并將測量時間設(shè)置成Z小值

2) 當(dāng)確定感興趣的頻段范圍之后，用開始和截止頻率限定頻段，并減小值以提高分辨率和靈敏度

3) 在運(yùn)行全掃寬掃描時，可切換至雙跡線模式，并通過標(biāo)記選擇感興趣的頻率

雙跡線模式

4) 停止全掃寬掃描，接收機(jī)自動切換至固定頻率模式，Z大中頻實時帶寬達(dá)10MHZ，可通過縮放操作，對信號進(jìn)行分析以及解調(diào)等。

當(dāng)頻譜儀和有源方向性的天線結(jié)合使用，對干擾進(jìn)行追蹤定位時，可按以下方式進(jìn)行操作

1) 將頻譜儀調(diào)諧到目標(biāo)干擾信號的ZX頻率

2) 解調(diào)帶寬必須大于等于干擾信號的帶寬，以獲得Z大的靈敏度（如果解調(diào)帶寬太窄，頻譜儀只測量到部分射頻電平，這樣會降低系統(tǒng)靈敏度）

3) 關(guān)閉自動頻率控制和手動增益控制，以避免接收機(jī)的自動調(diào)節(jié)效應(yīng)給測量結(jié)果帶來影響

4) 開啟均值檢波器以提供穩(wěn)定的電平讀數(shù)，將測量時間增加到200毫秒以提高穩(wěn)定度

5) 開啟單音Tone功能，對音頻音調(diào)進(jìn)行監(jiān)聽，有助于對信號進(jìn)行定位，而不必一直觀察屏幕上的電平值顯示；如果信號太強(qiáng)，可開啟衰減器ATT以免接收機(jī)過載

當(dāng)干擾信號與有用信號相鄰很近時，可按照以下方式進(jìn)行操作

1) 將接收機(jī)設(shè)置于有用信號的ZX頻率，掃寬設(shè)為10M赫茲

2) 寬帶頻譜中只顯示出有用信號頻譜

3) 使用縮放功能，突出ZX頻率以外的頻譜峰值，其他的峰值有可能是干擾信號

4) 選擇平均功能來平滑顯示曲線

5) 將測量時間設(shè)為100毫秒或更長。

當(dāng)干擾信號與有用信號同頻，但不同時發(fā)射時，可按以下方式操作

1) 將接收機(jī)工作與有用信號的ZX頻率，掃寬設(shè)置為10M赫茲

2) 選擇頻譜加瀑布圖組合顯示模式

3) 將中頻頻譜設(shè)為Z大保持模式，設(shè)置適當(dāng)?shù)臏y量時間，如100毫秒

4) 從瀑布圖明顯看出，有用信號發(fā)出之后，有一個發(fā)射時間不確定的干擾信號；如果只對頻譜進(jìn)行截屏，并不能很好的捕獲這兩個信號，但是在瀑布圖中可輕松地對其進(jìn)行監(jiān)測

當(dāng)短時的干擾信號隱藏在穩(wěn)定的有用信號中時，括號同一頻率可按以下方式進(jìn)行操作

1) 用全掃寬掃描顯示頻譜，如GSM900下行鏈路935MHz-960MHz

2) 在顯示的大量信號中，很難對短時干擾信號進(jìn)行分辨

3) 通過激活跡線差分運(yùn)算模式，將接收機(jī)DIFF MODE鍵按下時刻的頻譜保存為參考頻譜

4) 以后每次測量得到的頻譜都和參考頻譜進(jìn)行差值運(yùn)算

5) 兩個頻譜中都存在的穩(wěn)定信號將被YZ，而參考頻譜中不存在的新型號將會顯示出來

6) 這種模式可顯著降低需要對其進(jìn)行分析的峰值信號的數(shù)量，從而很方便的看出偶發(fā)干擾信號。

以上就是安泰測試為大家總結(jié)的使用便攜式頻譜分析儀排查無線電干擾時的優(yōu)化設(shè)置和使用技巧，大家運(yùn)用中可以作為參考。如需了解更多電子測量儀器儀表相關(guān)知識，歡迎訪問安泰測試網(wǎng)。

前言

拉曼光譜在復(fù)雜水體系中反映組分微小變化的能力深化了該技術(shù)在生物制藥過程分析（如生物反應(yīng)器中的細(xì)胞生長）方面的應(yīng)用。拉曼光譜儀技術(shù)可以實時、原位和無損地監(jiān)測生物制藥生產(chǎn)過程，可用于復(fù)雜化學(xué)體系的連續(xù)過程監(jiān)測。拉曼光譜技術(shù)在生物反應(yīng)過程中可檢測大量代謝物變化的能力已將該技術(shù)提升為強(qiáng)大的過程分析工具。

實驗概述

拉曼光譜分析光學(xué)探頭具有可重復(fù)使用的特點(diǎn)，通過減少運(yùn)行間的可變性來提高過程監(jiān)測的可重復(fù)性和可靠性。Thermo Scientific? Ramina? 過程分析儀可匹配多個光纖探頭。MarqMetrix 生物反應(yīng)器球形探頭是專為滿足生物工藝工業(yè)的要求而設(shè)計的，可以搭載到 Ramina 過程分析儀上使用。這些探頭具有快速、易于更換和連接以及耐用等特點(diǎn)，可以進(jìn)行無菌處理，比如離線的高壓滅菌。

DynaDrive 一次性生物反應(yīng)器(S.U.B.)是 S.U.B. 技術(shù)的最 新產(chǎn)品，為大規(guī)模生物生產(chǎn)提供了更好的性能，并具備可擴(kuò)展性。與傳統(tǒng)的 S.U.B. 設(shè)計相比，長方體的罐體具有幾個關(guān)鍵優(yōu)勢，包括優(yōu)越的混合和傳質(zhì)能力以及更好的可擴(kuò)展性。

本應(yīng)用介紹了Ramina過程分析儀系統(tǒng)與 500L HyPerforma DynaDrive 生物反應(yīng)器的集成，并實現(xiàn)關(guān)鍵過程參數(shù)(CPPs)的在線測量，通過采集整個細(xì)胞生長培養(yǎng)過程中連續(xù)生成的光譜數(shù)據(jù)建立起若干參數(shù)和代謝物的精確預(yù)測模型。

材料與方法

細(xì)胞培養(yǎng)和喂養(yǎng)策略

細(xì)胞培養(yǎng)在500L HyPerforma DynaDrive S.U.B 中進(jìn)行（見下圖1），其中包含體積約為320L細(xì)胞培養(yǎng)基，在36.5℃，pH=6.9+/-0.3, DO=50%的條件下接種0.5x106個細(xì)胞/mL。體系的 pH 值通過添加二氧化碳?xì)怏w和碳酸鈉來控制。

細(xì)胞在化學(xué)定義的培養(yǎng)基中生長，從第3天開始每天進(jìn)行兩步喂養(yǎng)過程。第 一種喂養(yǎng)介質(zhì)以起始體積的重量為4%添加，第二種喂養(yǎng)介質(zhì)以0.4%添加。第6天體系溫度轉(zhuǎn)為33°C。試驗在14天后終止。生物反應(yīng)器避光處理以防止雜散光干擾。在高壓滅菌后，將 Ramina 過程分析儀生物反應(yīng)器球形探頭插入HyPerforma DynaDrive S.U.B. 中，進(jìn)行在線實時拉曼光譜數(shù)據(jù)采集。

圖1.500L Thermo Scientific HyPerforma 

DynaDrive S.U.B. 細(xì)胞培養(yǎng)罐

Ramina 過程分析儀測試

使用 Ramina 過程分析儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集（見下圖2）， Ramina 過程分析儀的生物反應(yīng)器球形探頭直接浸入在生物反應(yīng)器(500L) 中，每平均20次測量獲取一張拉曼光譜數(shù)據(jù)，積分/曝光時間為3秒，激光功率設(shè)置為450mW。每個數(shù)據(jù)光譜的總采集時間為2分鐘，在 Ramina 過程分析儀用以建立模型數(shù)據(jù)與離線儀器分析通過匹配時間戳以確認(rèn)。

圖2.Thermo Scientific? Ramina? 

在線拉曼分析儀

化學(xué)計量學(xué)模型建立

來自多臺 Ramina 過程分析儀、探頭和生物反應(yīng)器的數(shù)據(jù)被用于創(chuàng)建模型。訓(xùn)練數(shù)據(jù)集從每個生物反應(yīng)器的45個樣本中收集，以創(chuàng)建每個化學(xué)計量學(xué)模型。對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了檢查，剔除了由宇宙射線引起的異常譜峰。選擇感興趣的光譜區(qū)域，并對光譜進(jìn)行預(yù)處理，以去除基線干擾并優(yōu)化信噪比。

建模過程中測試了許多預(yù)處理技術(shù)，包括Savitzky Golay濾波、自動Whitaker平滑、多元散射校正、SNV和均值中心化。根據(jù)建模的關(guān)注點(diǎn)選擇優(yōu)化不同的預(yù)處理技術(shù)。為每個感興趣的組分創(chuàng)立偏最小二乘(PLS)模型并進(jìn)行交叉驗證以測試每個模型的優(yōu)化的效果。這些組分包括葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸、TCD、VCD和其他在生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的常見代謝物。

結(jié)果

在這項工作中，在線拉曼光譜儀應(yīng)用于連續(xù)分批補(bǔ)料 CHO 細(xì)胞培養(yǎng)過程。使用拉曼光譜監(jiān)測工藝參數(shù)首先需要使用外部校準(zhǔn)數(shù)據(jù)集（獨(dú)立離線數(shù)據(jù)）建立化學(xué)計量學(xué)模型，通過對感興趣的參數(shù)的離線分析數(shù)據(jù)和對應(yīng)的在線拉曼光譜數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)關(guān)系建立模型。

ACE HILIC法開發(fā)平臺和工作實例

圖17顯示了HILIC方法開發(fā)的流程圖。
一般方法是：收集分析物相關(guān)的信息（如果已知的話），針對三個ACE HILIC相（用三款不同的ACE HILIC色譜柱在不同的pH洗脫液條件下）執(zhí)行梯度或等度HILIC篩選實驗（取決于樣本分析物的親水性范圍），然后再優(yōu)化色譜法以達(dá)到可接受的HILIC法。
表1中列出了ACE HILIC篩選條件。

這些設(shè)計旨在探索廣泛的選擇性范圍，以及為達(dá)到所需分離提供一個良好的起點(diǎn)。

圖17
ACE HILIC 方法開發(fā)流程圖

表1
ACE HILIC篩選實驗的條件

ACE HILIC色譜柱保存方法

使用之后，ACE HILIC色譜柱應(yīng)使用體積比為7:3的乙腈和水進(jìn)行沖洗，清除掉所有的緩沖鹽。

然后，使用的異丙醇、以更低的流速進(jìn)行沖洗，以便貯存。應(yīng)往回擰緊色譜柱端蓋（擰緊色譜柱端蓋），并將色譜柱放回盒內(nèi)。

每次分析運(yùn)行之后，除非第二天要使用，否則建議采用密閉法（按長期保存的方法）清洗色譜柱，然后用異丙醇沖洗。

實例1 – 咖啡茵和相關(guān)化合物

方法開發(fā)中所需的咖啡茵和四種相關(guān)化合物（可可堿、茶堿、次黃嘌呤和黃嘌呤）這些化合物都是極性的中性物質(zhì)，其中負(fù)log P值表示合理的親水性（log P為負(fù)值明確的表明其親水性），因此適用于HILIC（圖18）。

圖18
咖啡茵和相關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和log P數(shù)據(jù)

咖啡茵和相關(guān)化合物在pH為3-6的情況下不可電離，因此洗脫劑的pH幾乎不會直接影響分子。

為此，選擇pH 3.0和4.7。

固定相會受洗脫劑pH變化的影響，這可能是有利的一面。

固定相的電離變化將影響粒子周圍的水合層，這會影響分析物分散到相中（分配在固定相上）或形成氫鍵的程度。

因此，在pH3.0和pH4.7的情況下對三個固定相進(jìn)行篩選，結(jié)果如圖19中所示。
新的ACE HILIC色譜柱使用60倍柱體積相互平衡（平衡），以在粒子周圍形成水合層。表1中顯示了流動相、梯度和溫度。
篩選結(jié)果顯示：三個固定相與兩個pH值之間觀察到一些選擇性差異（三個固定相在兩個pH值下的篩選結(jié)果可以看出彼此間具有選擇性的差異）。

基于篩選數(shù)據(jù)的Z有效分離是針對pH為3.0下的（pH為3.0下的）ACE HILIC-N相。

這些數(shù)據(jù)選擇（選定這些條件）用于進(jìn)一步優(yōu)化。

圖19
ACE HILIC色譜柱的梯度篩選

條件如表1中所述，275nm條件下的檢測除外。進(jìn)樣25mg/mL的咖啡茵混合物2μL（使用pH3.0和pH4.7的甲酸銨，以0.5%w/w的比例混合相關(guān)物質(zhì)和MeCN/H2O（90:10 v/v））
樣本：
1) 咖啡茵

2) 茶堿
3) 可可堿
4) 黃嘌呤
5) 次黃嘌呤

較早洗脫峰的保留窗口（時間段）非常窄，這表示：等度HILIC可用于分離分析物。（等度方式的HILIC可以被用于分離這些化合物）10mM甲酸銨，pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（94:6 v/v）被選為等度條件（圖20）。

在這些條件下，峰4和5要保留得更多（好），但峰2和3仍未解析出（被分離）。
根據(jù)梯度運(yùn)行的結(jié)果，乙腈含量更高似乎不會提高峰2和3的解析度（高的乙腈含量沒有提高2與3峰的分離度），所以梯度HILIC分析得到改善（所以梯度分析是對混合物分離有更合適的，溫度將被研究），從而開發(fā)出Z終方法，如圖21所示。

圖20
ACE HILIC-N相中咖啡茵和相關(guān)化合物的等度分析

ACE HILIC-N相中咖啡茵和相關(guān)化合物的等度分析
色譜柱：ACE 5 HILIC-N，
150 x 4.6 mm
流動相：10 mM甲酸銨，pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（94:6 v/v）
流速：1.5 mL/min
溫度：25 °C
檢測：UV, 275 nm
進(jìn)樣：2 μL
樣本：
1) 咖啡茵

2) 茶堿
3) 可可堿
4) 黃嘌呤
5) 次黃嘌呤

溫度的降低會提高茶堿與可可堿之間的解析度（分離度），因此，Z終方法（圖21）被認(rèn)為適合其用途。

圖21
Z終開發(fā)方法：

色譜柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm
流動相：A = 10mM甲酸銨（pH3.0）溶于MeCN/H2O中（96:4 v/v）中 B = 10mM甲酸銨（pH3.0）溶于MeCN/H2O（1:1 v/v）中
梯度：0-B在15分鐘內(nèi)，B持續(xù)5分鐘，下一次進(jìn)樣維持在起始條件20分鐘
流速：1.5 mL/min
溫度：15 °C
檢測：275 nm
進(jìn)樣：2 μL

實例2 – 肌酸和肌酐

肌酸（圖22）是使用甘氨酸和精氨酸合成的氨基酸。

它在為體內(nèi)細(xì)胞提供能量方面起著重要作用（在體內(nèi)主要用于為細(xì)胞供能），并形成（生成）副產(chǎn)品肌酐。測定血液中的肌酐，確定腎功能是否正常，其中肌酐水平的增加表示腎可能不會完全過濾廢物。（升高表明腎的過濾廢物的功能有所降低）

圖22
結(jié)構(gòu)和log P肌酸和肌酐數(shù)據(jù)

圖23
使用pH為3.0、4.7和6.0的甲酸銨對ACE HILIC范圍的等度篩選對比
樣本：
1) 肌酐
2) 肌酸

在三種pH值條件下，利用等度條件對三個HILIC固定相的兩種分析物進(jìn)行篩選。

結(jié)果表明：肌酐在三個ACE HILIC相中被適當(dāng)?shù)乇Ａ簦捎谶^度保留的原因，肌酸在合理的時間內(nèi)沒有洗脫。

根據(jù)圖17中的流程圖，過度保留窗口表示梯度（寬時間段表明梯度方法）可能更適宜。

圖24
ACE HILIC-A相下的Z終方法

ACE HILIC-A在pH3.0下選擇，進(jìn)行梯度分析。

標(biāo)準(zhǔn)梯度在10分鐘內(nèi)析出兩種目標(biāo)分析物，并且解析度很高（分離度很高）（數(shù)據(jù)未顯示）。因此，這使得梯度時間進(jìn)一步減少（這種情況下可以使梯度運(yùn)行時間進(jìn)一步減少），從而縮短了整體運(yùn)行時間。

Z終方法如圖24中所示。

色譜柱：150 x 4.6 mm, 5 μm
流動相：
A：2 mM甲酸銨（pH3.0）溶于MeCN/H2O（90:10 v/v）中
B: 2 mM甲酸銨（pH3.0）溶于MeCN/H2O（50:50 v/v）中
梯度：5-55%B，在10分鐘內(nèi)
流速：1.5 mL/min
檢測：230 nm
進(jìn)樣：5 μL
樣本：
1) 肌酐
2) 肌酸

結(jié)論

HILIC是一種用于多用途的極性分析物色譜分析法（對于極性化合物來說是一種通用的色譜分析模式）。

這種方法比較復(fù)雜，但如果遵循簡單規(guī)則，則可實現(xiàn)可再現(xiàn)的HILIC方法（HILIC方法是可以重現(xiàn)性的）。

三個ACE HILIC相（固定相）設(shè)計用于HILIC方法開發(fā)期間研究選擇性，并盡可能快地提供實現(xiàn)所需分離的選項。

ACE HILIC方法驗證協(xié)議（規(guī)程）已成功用于開發(fā)一系列的HILIC方法，應(yīng)為HILIC方法開發(fā)活動提供一種結(jié)構(gòu)化的方法。