血清有必要做熱滅活嗎?

　　血清   實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細(xì)胞的生長只有微小的促進(jìn)，或沒有任何作用，甚至通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量，而造成細(xì)胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是小黑點(diǎn)，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。若非必須，可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時(shí)間，更確保血清的質(zhì)量!

　　在此，我們解析血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：

　　1. 牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。并應(yīng)具備適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測系統(tǒng)。

　　2. 證明所用牛血清中不含對所生產(chǎn)疫苗病毒的yizhi物。

　　3. 有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。

　　4. 無細(xì)菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國家要求無細(xì)菌噬菌體污染。

　　5. 對細(xì)胞有良好的支持繁殖作用。

　　6. 血清要通過濾膜過濾除菌，無菌。

　　血清有必要做熱滅活嗎?本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承：遵紀(jì)守法，嚴(yán)于律己，寬仁以待，敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn)，以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護(hù)和拓展市場，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作，共創(chuàng)美好的未來。

根據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊（試行第二版）》通知，“人群篩查應(yīng)選擇具有病毒滅活功能，如含胍鹽（異硫氰酸胍或鹽酸胍等）或表面活性劑的采樣管?！?br style="margin: 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box; overflow-wrap: break-word !important; visibility: visible;"/>

滅活型病毒采樣管可高效滅活病毒，保護(hù)病毒核酸不被降解，且能在常溫下保存較長時(shí)間，為樣品保存及運(yùn)輸節(jié)省成本。選擇滅活效果好的病毒采樣管，有助于確保后續(xù)核酸檢測質(zhì)量。

本期實(shí)驗(yàn)，我們選取逗邦?一次性使用病毒采樣管進(jìn)行滅活效果測試，過程如下：

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實(shí)驗(yàn)材料

病毒采樣管：

逗邦?一次性使用病毒采樣管（滅活型）

實(shí)驗(yàn)材料：

慢病毒（吉凱基因，GCNL0319432），HEK293T細(xì)胞

核酸提取試劑盒和提取儀：

逗邦?（BNP027-2B, M32)

新冠熒光PCR試劑盒：

圣湘（N083-5X0001）

逗邦?一次性使用病毒采樣管（滅活型）

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實(shí)驗(yàn)方法

參考《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002版）病毒滅活試驗(yàn)中描述的檢測方法，確定病毒保存管滅活能力。

步驟一：細(xì)胞培養(yǎng)

將生長狀態(tài)良好的HEK293T細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至1×104/mL，按照100μL/孔的體積，每個(gè)梯度的病毒做三個(gè)復(fù)孔，計(jì)算所需接種孔數(shù)，將細(xì)胞緩慢均勻接種至96孔板中。放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

步驟二：慢病毒稀釋

將病毒滴度為107-108TU/mL的慢病毒按10倍梯度進(jìn)行稀釋，連續(xù)稀釋3個(gè)梯度。

步驟三：病毒滅活

把稀釋好的病毒置于室溫條件下，與滅活款病毒保存液（批號：220201/220207/220211）按1:1體積比進(jìn)行混合，置于室溫下分別放置1min、5min和10 min進(jìn)行滅活。

步驟四：終止滅活

采用病毒分離培養(yǎng)基（可用DMEM完全培養(yǎng)基替代）進(jìn)行1000倍稀釋以中和滅活保存液，終止滅活。

陰性對照：為病毒分離培養(yǎng)基對滅活款病毒保存液稀釋1000倍的混合液；

陽性對照：為病毒分離培養(yǎng)基對病毒原液稀釋1000倍的混合液。

步驟五：病毒孵育

將事先培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞中吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔加入100μL準(zhǔn)備好的病毒混合液，和對應(yīng)的陽性對照、陰性對照。病毒孵育3小時(shí)，每隔30分鐘從培養(yǎng)箱中取出晃動一次。

步驟六：細(xì)胞培養(yǎng)

孵育結(jié)束后，將病毒液吸去，每孔中加入100μL DMEM完全培養(yǎng)基，將96孔板置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞狀態(tài)。

步驟七：熒光細(xì)胞觀察與計(jì)數(shù)

繼續(xù)培養(yǎng)48-72h，期間觀察細(xì)胞狀態(tài)，若細(xì)胞培養(yǎng)液變黃，應(yīng)換液，對熒光細(xì)胞個(gè)數(shù)適量的孔進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算病毒滴度。

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實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1：三批次滅活款病毒保存管在病毒滅活

不同時(shí)間后細(xì)胞生長情況

表1：三批次滅活款病毒保存管在病毒滅活

不同時(shí)間后病毒滴度情況

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實(shí)驗(yàn)結(jié)論

由圖1和表1數(shù)據(jù)可以看出，慢病毒經(jīng)滅活1min、5min和10min后感染HEK293T細(xì)胞后，在顯微鏡明場下細(xì)胞生長正常；三批次的滅活款病毒保存管與病毒作用5min后，可以有效滅活病毒。