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  白富帥000 2017-05-07 00:00:00

  雙脫氧鏈終止法是現(xiàn)在應(yīng)用Z多的核酸測序技術(shù)（也即diyi代DNA測序技術(shù)），由Sanger等1977年發(fā)明提出。主要用于DNA基因分析。其原理是： 核酸模板在核酸聚合酶、引物、四種單脫氧堿基存在條件下復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時，如果在四管反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例引入四種雙脫氧堿基，只要雙脫氧堿基摻入鏈端，該鏈就停止延長，鏈端摻入單脫氧堿基的片段可繼續(xù)延長。 如此每管反應(yīng)體系中便合成以共同引物為5’端，以雙脫氧堿基為3’端的一系列長度不等的核酸片段。反應(yīng)終止后，分四個泳道進行電泳。以分離長短不一的核酸片段（長度相鄰者僅差一個堿基），根據(jù)片段3’端的雙脫氧堿基，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。 Sanger雙脫氧鏈終止法（酶法）測序程序 操作程序是按DNA復(fù)制和RNA反轉(zhuǎn)錄的原理設(shè)計的。 1.分離待測核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是雙鏈，也可以是單鏈。 2.在4只試管中加入適當(dāng)?shù)囊?、模板?種dNTP（包括放射性標(biāo)記的ddNTP，例如32P ddNTP和DNA聚合酶（如以RNA為模板，則用反轉(zhuǎn)錄酶），再在上述4只管中分別加入一種一定濃度的ddNTP（雙脫氧核苷酸）。 3.與單鏈模板（如以雙鏈作模板，要作變性處理）結(jié)合的引物，在DNA聚合酶作用下從5’端向3’端進行延伸反應(yīng)，32P隨著引物延長摻入到新合成鏈中。當(dāng)ddNTP摻入時，由于它在3’位置沒有羥基，故不與下一個dNTP結(jié)合，從而使鏈延伸終止。ddNTP在不同位置摻入，因而產(chǎn)生一系列不同長度的新的DNA鏈。 4.用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳同時分離4只反應(yīng)管中的反應(yīng)產(chǎn)物，由于每一反應(yīng)管中只加一種ddNTP（如ddATP），則該管中各種長度的DNA都終止于該種堿基（如A）處。所以凝膠電泳中該泳道不同帶的DNA 3’ 末端都為同一種雙脫氧堿基。 5.放射自顯影。根據(jù)四泳道的編號和每個泳道中DNA帶的位置直接從自顯影圖譜上讀出與模板鏈互補的新鏈序列。

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