考慮到mRNA轉(zhuǎn)錄的高度動態(tài)特性以及樣品處理和下游處理步驟中引入的潛在變量，RT-qPCR工作流程的每個步驟的標準化方法對于可靠和可重現(xiàn)的結(jié)果至關(guān)重要。MIQE為這種方法提供了一份包含85個參數(shù)的清單，以確保質(zhì)量結(jié)果符合任何期刊的接受標準。接下來，小編將為大家詳細介紹如何應(yīng)用MIQE指南來建立一個可靠的RT-qPCR實驗流程。

1、實驗設(shè)計

正確的實驗設(shè)計是任何基因表達研究的關(guān)鍵。由于mRNA轉(zhuǎn)錄對與研究過程無關(guān)的外部刺激敏感，因此嚴格控制和設(shè)計實驗條件的工作是十分重要的。其中包括了確定實驗程序、對照組、重復(fù)組的類型和數(shù)量、實驗條件以及各組內(nèi)的樣品處理方法等，這些對于最小化變異性至關(guān)重要（表1）。

2、RNA提取及質(zhì)控

樣品需-80℃冷凍或使用RNA儲存溶液進行儲存。RNA提取程序應(yīng)包括DNA酶處理步驟，以去除任何的基因組DNA污染。

確保僅使用高純度（無污染物）和高完整性（未降解）的RNA是RT-qPCR實驗工作流程中最關(guān)鍵的一點。RNA樣本中的雜質(zhì)可能導(dǎo)致RT和PCR的YZ，從而導(dǎo)致不同和不正確的定量結(jié)果。由于樣品純度和完整性不相關(guān)，因此應(yīng)評估兩者確定RNA樣本符合下游工作流程的ZD驗收標準。

3、逆轉(zhuǎn)錄

考慮到RNA酶在環(huán)境中的普遍存在，建議在質(zhì)量控制評估后立即將總RNA樣本反轉(zhuǎn)錄成cDNA。這將避免RNA樣品在轉(zhuǎn)化為cDNA之前多次冷凍/解凍而降解的風險。對于RT步驟，關(guān)鍵是確保提取的RNA樣本中轉(zhuǎn)錄基因組的一致性和完整性。建議使用相同數(shù)量的總RNA，并保持所有實驗樣本的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時間，以最小化生物復(fù)制之間的變異性。

4、引物和擴增子設(shè)計

引物設(shè)計和靶序列的選擇是保證擴增產(chǎn)物特異性和GX性的關(guān)鍵。目前有許多軟件或在線網(wǎng)站可設(shè)計引物對和確定擴增子，比如DNAMAN、Primer Premier、Oligo、Beacon Designer、Primer-Blast、BathPrimer、Primer3 Plus等等。

5、qPCR驗證

qPCR驗證是使用一組標準樣品對引物退火溫度、反應(yīng)效率和特異性的適度范圍進行評估的方法。具體步驟如下：

1)根據(jù)儀器類型，選擇合適的耗材和qPCR試劑；

2)配置不同的PCR反應(yīng)體系，凝膠電泳檢測引物適宜濃度以及特異性；

3)設(shè)置溫度梯度測試引物適宜退火溫度；

4)實驗設(shè)置NTC、NRC、POS和NEG等對照組，來監(jiān)控實驗體系或污染；

5)標準曲線的建立(評價PCR效率)。

6、內(nèi)參基因的選擇

在RT-qPCR實驗中，內(nèi)參基因可以用于校正上樣量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結(jié)果的準確性。一個好的內(nèi)參基因應(yīng)在不同時空樣本或不同處理樣本中具有相對穩(wěn)定的表達水平，常見的有ATCB、GAPDH、β-actin、18S rRNA等。

7、實驗重復(fù)性

基因表達實驗中有兩種可能影響結(jié)果的變異來源：

1)由于個體有機體、組織或細胞樣品之間基因表達水平的固有差異引起的生物變異性；

2)實驗過程本身的技術(shù)變異性，通常與移液器誤差、操作誤差或樣品質(zhì)量和數(shù)量有關(guān)。為了減輕生物和技術(shù)變異性的影響，一般認為至少三次生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)。

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