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  wyp6203 2017-12-16 08:10:25

  X晶體衍射。首先要得到蛋白質(zhì)的晶體。 通常，都是將表達(dá)蛋白的基因PCR之后克隆到一種表達(dá)載體中，然后在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，提純之后摸索結(jié)晶條件，等拿到晶體之后，工作便完成的80％，將晶體進(jìn)行x射線衍射，收集衍射圖譜，通過一系列的計(jì)算，很快就能得到蛋白質(zhì)的原子結(jié)構(gòu)。 所以x射線方法解析蛋白的瓶頸是摸索蛋白結(jié)晶的條件。 X射線衍射方向決定于晶體的周期或晶面間隔，但是，在周期相同或晶面間隔相同的情況下，由于晶胞內(nèi)原子排布方式不同，則會(huì)造成衍射點(diǎn)強(qiáng)度不同。也就是說，衍射點(diǎn)強(qiáng)度的大小包含著與分子結(jié)構(gòu)有關(guān)的信息。分子結(jié)構(gòu)中所有原子對每一個(gè)衍射斑點(diǎn)的強(qiáng)度都有各自的貢獻(xiàn)，因此，通過分析X射線衍射點(diǎn)的強(qiáng)度，可以得到有關(guān)晶胞內(nèi)原子排布的信息。常用的晶體衍射強(qiáng)度的記錄有兩種方式。一種是將晶體所產(chǎn)生的衍射光束點(diǎn)記錄在底片上，如經(jīng)典的感光膠片，然后，用掃描儀閱讀衍射強(qiáng)度。近年來發(fā)展起來的象板探測器，實(shí)際上是用象板取代了感光膠片，免除了顯影、定影等麻煩。另一種方法是多絲正比面探測器，先將衍射光束光子信號轉(zhuǎn)換為電子信號，再處理為衍射強(qiáng)度。還可以采用CCD技術(shù)，使數(shù)據(jù)采集精度和信號轉(zhuǎn)換速度得到較大的提高。這非常重要，因?yàn)樯锎蠓肿泳w結(jié)構(gòu)解析的分辨率和精度主要取決于晶體衍射數(shù)據(jù)采集的質(zhì)量和精度。多波長反常散射法成為近年來發(fā)展較快的一種方法。生物大分子中通常含有金屬離子或重原子，不同的原子對不同波長的X射線具有特征的反常散射效應(yīng)。同步輻射光源具有強(qiáng)度高、單色性好、波長連續(xù)可調(diào)的特點(diǎn)，在進(jìn)行生物大分子晶體衍射實(shí)驗(yàn)時(shí)，如果晶體中含有金屬離子或重原子，則可以將同步輻射光源的波長調(diào)整到對應(yīng)原子反常散射明顯的位置，獲得反常散射數(shù)據(jù)，從而進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)的解析。生物大分子的二級結(jié)構(gòu)常常是螺旋結(jié)構(gòu)（如蛋白質(zhì)中的a螺旋和DNA的雙螺旋），其特點(diǎn)是每一圈螺旋中(即每一周期)包含一定數(shù)量的、散射能力相同的結(jié)構(gòu)單元。具有螺旋結(jié)構(gòu)的生物大分子，其X射線衍射圖有相應(yīng)的特點(diǎn)。凡是衍射圖上具有這些特點(diǎn)的物質(zhì)，如纖維狀蛋白質(zhì)、DNA，其結(jié)構(gòu)均為螺旋結(jié)構(gòu)。利用從衍射圖得到的衍射數(shù)據(jù)，可以分析出晶胞內(nèi)三維空間的電子密度分布，確定結(jié)構(gòu)模型。下面以肌紅蛋白為例加以說明。肌紅蛋白分子量為18000，含有153個(gè)氨基酸殘基，分子中有1200個(gè)原子(不包括氫原子)。為了定出分子中所有原子的位置，需要測量大約20000個(gè)衍射點(diǎn)的強(qiáng)度并計(jì)算其位相角。diyi階段分析到6的水平，定出多肽鏈和正鐵血紅素的位置，其中棒狀結(jié)構(gòu)符合a-螺旋的特征，推算出a-螺旋約占?xì)埢倲?shù)的70%。進(jìn)一步分析提高到2的水平，雖然不能定出每個(gè)原子的位置，但可以肯定分子的主要部分是由a-螺旋組成，而且是右手螺旋，鏈必須彎曲、盤繞。其中大約13~18個(gè)殘基不是a-螺旋，一半以上的氨基酸殘基能定出種類。再進(jìn)一步分析到1.5的水平，可以完全弄清楚氨基酸排列順序。這樣，通過X射線衍射的研究，可以確定蛋白質(zhì)一級、二級、三級結(jié)構(gòu)?？梢奨射線衍射分析是研究生物大分子結(jié)構(gòu)的強(qiáng)有力的工具。用X射線衍射技術(shù)分析分子結(jié)構(gòu)時(shí)，一般有以下幾個(gè)步驟：（1）用實(shí)驗(yàn)測定單個(gè)晶格的線度和從衍射圖中測量衍射點(diǎn)的強(qiáng)度；（2）根據(jù)上述數(shù)據(jù)，結(jié)合其它方法推斷原子排列，得到嘗試結(jié)構(gòu)模型，計(jì)算這種結(jié)構(gòu)的衍射極大值，然后與實(shí)驗(yàn)觀察值比較；（3）修正所提出的模型，直到計(jì)算結(jié)果和實(shí)際所得到的數(shù)據(jù)趨于吻合。X射線晶體學(xué)方法是測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要方法。球狀蛋白質(zhì)是多肽鏈卷曲成團(tuán)的蛋白質(zhì)，它和纖維狀蛋白不同，構(gòu)型一般比較復(fù)雜。球狀蛋白質(zhì)分子量大，表面基團(tuán)的構(gòu)象不穩(wěn)定，要獲得有序排列的晶體是比較困難的。所形成的晶體不可能是wan美的堆砌，而是會(huì)在分子之間形成許多大的孔或通道。這些通道常常由占晶體體積一半以上的溶劑分子所占有，而溶劑分子的絕大部分在晶體上又是無序的。晶體中的蛋白質(zhì)分子之間僅有少量的區(qū)域發(fā)生接觸，這些區(qū)域的相互作用也是較弱的相互作用，通常是通過一個(gè)或幾個(gè)溶劑分子發(fā)生作用。蛋白質(zhì)晶體的形成依賴于一些參數(shù)，如pH值、溫度、蛋白濃度、溶劑的種類、沉淀劑的種類以及金屬離子和某些蛋白的配基等。用X射線衍射圖分析DNA的空間結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)螺旋結(jié)構(gòu)的衍射圖樣，說明每一圈螺旋有10個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)單元，反映了分子間的排列情況。根據(jù)DNA的X射線衍射圖結(jié)合其它技術(shù)，Watson和Crick提出了DNA的空間結(jié)構(gòu)模型：兩條多核苷酸鏈組成反平行的右手雙螺旋，磷酸在外，堿基在內(nèi)；螺距為34，每圈螺旋包含10個(gè)核苷酸，每個(gè)核苷酸軸長為3.4，螺旋直徑為20；兩條鏈之間形成氫鍵。

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