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  戮天王者 2010-09-20 00:00:00

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  NULO人 2010-09-20 00:00:00

  其中10´加樣緩沖液（或6´加樣緩沖液）在酶等試劑里都有，一般不用自己配置。 實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒DNA電泳鑒定 1．目的 學(xué)會(huì)常用的DNA瓊脂糖凝膠電泳、。 2．原理 DNA雙螺旋分子骨架兩側(cè)帶有含負(fù)電荷的磷酸根，在電場中會(huì)向正極方向移動(dòng)。不同長度的DNA由于受到凝膠介質(zhì)的阻力不同，表現(xiàn)為不同的遷移率而被分開。 3．器材 電泳儀，水平凝膠電泳槽和梳子及其制膠模塊，250ml三角瓶，微波爐，臺(tái)式離心機(jī)，旋渦混合器，凝膠成像系統(tǒng)，分光光度計(jì)，微量移液取樣器，1.5ml離心管，雙面離心管架，試管架等。 4．試劑 TAE電泳緩沖液，1000´溴化乙錠儲(chǔ)存液，電泳級瓊脂糖粉，10´加樣緩沖液（或6´加樣緩沖液），DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（lDNA HindIII: 23130，9420，6560，4360，2320，2030，560，130 bp）。 5．實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 配制TAE電泳緩沖液（50´儲(chǔ)存液，pH約8.5：Tris堿 242g，57.1ml冰乙酸，37.2g Na2EDTA.2H2O，dd water 定容至1L），1000´溴化乙錠儲(chǔ)存液（0.5mg/ml：50mg溴化乙錠溶于100mL dd water，4°C避光儲(chǔ)存），10´加樣緩沖液（20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚藍(lán)）；6´加樣緩沖液（0.25%溴酚藍(lán)，40%蔗糖水溶液）；1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）。 6．操作步驟 （1） 稱取0.5g瓊脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml TAE電泳緩沖液(1´)，放入微波爐中燒開（1min）。50ml 正好到兩塊小膠。 （2） 注意觀察燒瓶中的瓊脂糖粉末，待完全熔化后停止微波爐（切不可讓膠溶液溢出到微波爐中！）。 （3） 戴上線手套，從微波爐中取出三角瓶，置桌面上冷卻致不燙手（約50-60°C）。 （4） 把梳子插到凝膠灌制模具的正確位置后緩緩倒入膠溶液。與模具的矮邊緣相平即可，不要把膠溶液溢到外面。在桌面上靜置10-20分鐘待膠完全凝固。（剩下的膠溶液封口后留待以后再使用）。 （5） 在水平電泳槽中加滿1´TAE電泳緩沖液。根據(jù)電泳槽的長度把電泳儀的電壓調(diào)至170V(10V/cm)，注意正負(fù)電極的位置連接正確。 （6） 待膠完全凝固后（15-20分鐘），小心拔出梳子。用手指捏住模具兩側(cè)的高邊緣取出模具和凝膠放入電泳槽中間的平臺(tái)上，凝膠要沒入電泳液中。凝膠上有樣品孔的一側(cè)要朝向電泳槽的負(fù)極。 （7） 取1個(gè)1.5ml離心管，各加入1ml 10´加樣緩沖液。分別加入6ml蒸餾水，再加入3ml質(zhì)粒DNA溶液制成10ml DNA樣品。 （8） 在凝膠上選擇四個(gè)相鄰的加樣孔。用10ml的吸液頭分別將管中的樣品加入凝膠的加樣孔中，在相鄰的加樣孔中加入1.5-3ml DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物。加樣時(shí)持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住這只手的手腕，以減少移液器的抖動(dòng)。看到藍(lán)色的樣品吸管尖頭伸進(jìn)加樣孔后（不能伸得太深，以免穿破凝膠的底部）緩緩將藍(lán)色的樣品壓入加樣孔中。切不可使藍(lán)色樣品流到孔外。 （9） 打開電源開關(guān)，樣品將形成一條藍(lán)色的橫帶向前移動(dòng)（如果發(fā)現(xiàn)藍(lán)色向后移動(dòng)，立即關(guān)閉電源，調(diào)換電極）。電泳將進(jìn)行約30min。 （10） 當(dāng)藍(lán)色的溴酚藍(lán)遷移到距凝膠邊緣1cm時(shí)，關(guān)閉電源。取出模具和凝膠。 （11） 把凝膠小心反扣放入塑料盒子中，在膠上估計(jì)有DNA的位置上滴兩滴EB，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)凝膠，使EB均勻分布在膠上。放置3分鐘后，加入自來水淹沒凝膠，在脫色搖床上輕輕搖動(dòng)5min，棄掉水溶液，再加入自來水搖洗10min。放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照。 （12） 清理垃圾。染有EB的凝膠要放到專用的垃圾袋中作專門處理，以免污染環(huán)境。 （13） 撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

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