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  CH68453622 2017-10-07 07:24:39

  1 核酸變性 ?核酸的變性主要指DNA的變性。核酸變性時(shí)雙鏈間的氫鍵斷裂成單鏈，但并不涉及共價(jià)鍵的斷裂。引起DNA變性的因素很多，如高溫引起的熱變性，酸堿改變引起的酸堿變性等。 ?2 DNA熱變性現(xiàn)象 ?當(dāng)把DNA的稀鹽溶液加熱到80℃～100℃時(shí)，雙螺旋結(jié)構(gòu)即發(fā)生解體，兩條鏈分開形成無(wú)規(guī)則線團(tuán)。同時(shí)，一系列物化性質(zhì)發(fā)生改變：260nm處紫外吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高。由于二級(jí)結(jié)構(gòu)的喪失，也失去了部分或全部生物活性。 ?3 增色效應(yīng)和減色效應(yīng) ?當(dāng)DNA分子加熱變性后，其260nm的紫外吸收會(huì)急劇增加的現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。變性DNA復(fù)性后，在260nm處的吸收值減少的現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)。 ?4 DNA的復(fù)性 ?變性DNA在適當(dāng)條件下，又可使兩條彼此分開的多核苷酸鏈重新結(jié)合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，以上過(guò)程稱為復(fù)性。復(fù)性的條件是：(1)變性DNA只有在緩慢冷卻時(shí)才能復(fù)性。如果DNA在沸水浴中加熱數(shù)分鐘后，驟然在冰浴中冷卻至低溫，DNA不能復(fù)性，這也是防止復(fù)性的方法。(2)DNA濃度愈大，復(fù)性愈快。(3)DNA片段愈長(zhǎng)，復(fù)性也愈快。 ?5 核酸分子雜交 ?DNA雜交是指不同來(lái)源的DNA經(jīng)熱變性后，在慢慢冷卻的復(fù)性過(guò)程中，由于異源DNA之間的某些區(qū)域有相同的序列，可以彼此結(jié)合形成雜交分子，稱此方法為DNA分子雜交。DNA也可與互補(bǔ)的RNA之間發(fā)生雜交，形成DNA—RNA雜交分子。 ?核酸雜交可在液相或固相上進(jìn)行，由于硝酸纖維素膜只吸附變性DNA，故常用硝酸纖維素膜作核酸雜交的支持介質(zhì)。 ?6 如何應(yīng)用核酸的紫外吸收 ?由于嘌呤和嘧啶在240nm～290nm紫外線處表現(xiàn)出強(qiáng)烈的吸收性能，所以可以利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定堿基、核苷、核苷酸和核酸，它們的Z大吸收峰值在260nm附近。不同核苷酸有不同的吸收特性，可以此作定性定量檢測(cè)。 ?在研究中常用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)少量的DNA和RNA，純樣品和不純樣品的檢測(cè)根據(jù)是： ?純DNA：OD260／OD280＝1．8 ?純RNA：OD260／OD280＝2 ?樣品中如含雜蛋白及苯酚(它們?cè)谧贤庖灿形?，比值明顯降低，故不純樣品不能用此法定量。 ?7 熔解溫度(Tm）是指什么?受什么因素影響? ?DNA變性的特點(diǎn)是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)。通常把DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)的溫度稱為該DNA的熔解溫度（Tm）或稱熔點(diǎn)。DNA的Tm值一般在70℃～80℃之間。 ?影響DNA的Tm值的因素有： ?(1)DNA的均一性。均一性愈高的樣品，熔解過(guò)程愈是發(fā)生在一個(gè)很小的范圍內(nèi)。 ?(2)G—C之含量。由于G—C之間有3個(gè)氫鍵，因此G—C含量愈高，其Tm值也愈高，成正比關(guān)系。所以測(cè)定Tm值，可推算出G—C對(duì)的含量，其經(jīng)驗(yàn)公式為：G—C％＝（Tm－69．3）×2．24。 ?（3）介質(zhì)中離子強(qiáng)度的影響。一般來(lái)說(shuō)，離子強(qiáng)度愈低的介質(zhì)中，DNA的熔解溫度也較低，且熔解溫度范圍也較窄。所以DNA制備應(yīng)保存在較高濃度的緩沖液中，常在1mol·mL－1的NaCl溶液中保存。

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