偏光顯微鏡在中藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，正在為藥材的研究與鑒定提供重要的科學(xué)依據(jù)。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與中藥研究的不斷深入，偏光顯微鏡憑借其獨(dú)特的光學(xué)原理和高分辨率成像優(yōu)勢(shì)，已成為藥物鑒定和質(zhì)量控制的重要工具。本文將探討偏光顯微鏡在中藥領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，具體分析其適用范圍以及在中藥材鑒別、質(zhì)量控制和有效成分研究中的關(guān)鍵作用。

偏光顯微鏡的工作原理

偏光顯微鏡通過利用光的偏振特性，將光束分為不同方向的偏振光，再通過分析這些偏振光的反射和折射特性來進(jìn)行觀察。中藥材中的一些細(xì)微結(jié)構(gòu)和晶體，特別是礦物質(zhì)、植物細(xì)胞的組織及其內(nèi)的活性成分，能夠通過偏光顯微鏡被清晰地顯示出來。因此，偏光顯微鏡成為鑒別中藥中微觀結(jié)構(gòu)及其內(nèi)含物的重要工具。

偏光顯微鏡適用于哪些中藥

1. 礦物藥材 偏光顯微鏡廣泛應(yīng)用于礦物藥材的鑒別，如石膏、滑石、黃鐵礦等。這些礦物藥材中的結(jié)晶體在顯微鏡下呈現(xiàn)出明顯的偏光現(xiàn)象。通過觀察礦物的結(jié)晶結(jié)構(gòu)及其在偏光下的表現(xiàn)，可以有效地區(qū)分不同的礦物藥材，確保其質(zhì)量與。

2. 植物藥材 對(duì)于植物藥材，偏光顯微鏡能揭示其細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)特征。例如，植物細(xì)胞中的晶體（如草酸鈣晶體）在顯微鏡下會(huì)顯示出獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)。通過分析植物藥材的晶體類型和形態(tài)，偏光顯微鏡可以用于區(qū)分不同品種的藥材，如薄荷葉、丹參等草本植物的鑒定。

3. 動(dòng)物藥材 動(dòng)物藥材中，某些組織如骨骼、角質(zhì)和其他結(jié)晶結(jié)構(gòu)也能夠通過偏光顯微鏡進(jìn)行分析。例如，動(dòng)物角質(zhì)中的結(jié)晶物質(zhì)在偏光下呈現(xiàn)不同的光學(xué)表現(xiàn)，可幫助判斷其來源及品質(zhì)。

4. 化學(xué)成分的研究 偏光顯微鏡還廣泛用于中藥有效成分的研究。許多中藥成分如生物堿、黃酮類和其他天然產(chǎn)物，在顯微鏡下具有獨(dú)特的光學(xué)特性。借助偏光顯微鏡的高分辨率觀察，可以準(zhǔn)確識(shí)別和分析這些成分，進(jìn)而為中藥的標(biāo)準(zhǔn)化及質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

偏光顯微鏡的優(yōu)勢(shì)

偏光顯微鏡在中藥研究中具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。它能夠通過非破壞性的方法觀察藥材的微觀結(jié)構(gòu)，不會(huì)對(duì)藥材產(chǎn)生任何改變。偏光顯微鏡操作簡(jiǎn)單，圖像清晰，能幫助研究人員快速而準(zhǔn)確地進(jìn)行藥材的鑒定。它的高分辨率使得對(duì)于微小的晶體和結(jié)構(gòu)特征的分析更加精確，尤其在中藥復(fù)雜成分的研究中發(fā)揮了重要作用。

結(jié)語

偏光顯微鏡作為一種高效的檢測(cè)工具，廣泛適用于礦物、植物、動(dòng)物藥材的鑒定以及中藥有效成分的研究。通過偏光顯微鏡的應(yīng)用，科研人員能夠更準(zhǔn)確地識(shí)別和分析中藥材的質(zhì)量，為中藥的現(xiàn)代化與標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。在未來，中藥領(lǐng)域的研究與應(yīng)用將更加依賴于這一技術(shù)的深入發(fā)展與創(chuàng)新。

　　1. 基本信息

　　下面的應(yīng)用描述了小鼠巨噬細(xì)胞系RAW-264.7（生物安全等級(jí)2）在ibidi μ-Slides VI 0.4 和8孔腔室載玻片的培養(yǎng)方案。這是一個(gè)特殊的細(xì)胞系的例子，用于顯示粘附時(shí)間，細(xì)胞密度和細(xì)胞形態(tài)的示范。本應(yīng)用可根據(jù)您的具體實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行調(diào)整。

　　2. 材料

　　在設(shè)置中應(yīng)用下列材料：

　　·RAW-264.7 (murine macrophages, CLS - Cell Lines Service, Biosafety Level 2) 

　　·Medium: RPMI 1640 with 2 mM L-Glutamin and 10% FBS 

　　·μ-Slide VI 0.4, ibiTreat （ibidi 80606）

　　·μ-Slide 8 well, ibiTreat （ibidi 80826）

　　·Accutase (PAA Laboratories GmbH) 

　　·1x Phosphate buffered saline (PBS) 

　　3. 細(xì)胞培養(yǎng)與材料制備

　　在將細(xì)胞接種到玻片中之前，按照常規(guī)的方法培養(yǎng)細(xì)胞。

　　μ-Slide VI 0.4 ：通道玻片和培養(yǎng)基，在37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。這對(duì)于避免隨著時(shí)間的推移出現(xiàn)氣泡至關(guān)重要。為此，在50 ml器中填充適量的培養(yǎng)基，并輕輕地將瓶蓋擰緊。在 μ-Slide 8孔載玻片開放孔井中，氣泡可排出到大氣中。

　　拆開μ-Slide的包裝，把它放在μ-Slide支架上，并在準(zhǔn)備細(xì)胞懸浮液時(shí)同時(shí)將蓋子放在 Luer 適配器/孔上。

　　4. 播種細(xì)胞

　　分離細(xì)胞：

　　吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，并用PBS洗滌細(xì)胞一次。每75cm2 燒瓶中加入3-5 ml的Accutase，并將燒瓶放入培養(yǎng)箱中以加快分離速度。如果是RAW-264.7細(xì)胞系，則大約需要8分鐘。使用Accutase分離的細(xì)胞存活率更高。

　　4.1. 將細(xì)胞接種到μ-Slide VI 0.4中

　　在μ-Slide VI 0.4建議的細(xì)胞濃度：最終細(xì)胞數(shù)  0.3 x 10 5 cells/cm2，制備濃度6 x 10 5cells/ml。通過將移液器尖端直接放在通道的入口上，將30 μl細(xì)胞懸浮液填充到每個(gè)通道中。將蓋子蓋在玻片上，在37°C和5％CO2下孵育半小時(shí)以固定細(xì)胞。

　　細(xì)胞貼壁后，分別用60 μl無細(xì)胞培養(yǎng)基填充儲(chǔ)液池。 避免將移液器吸頭直接指向通道的入口。將玻片放回培養(yǎng)箱中。

　　圖1：接種后一小時(shí)，在ibiTreat μ-Slide VI 0.4（貨號(hào)80606）中的RAW-264.7

　　圖2: 在ibiTreat μ-Slide VI 0.4中的RAW-264.7，孵育24小時(shí)后

　　圖3:在ibiTreat μ-Slide VI0.4中的RAW-264.7，培養(yǎng)四天后

　　4.2 將細(xì)胞播種在μ-Slide 8 well 中

　　在μ-Slide 8 well建議的細(xì)胞濃度：最終細(xì)胞數(shù) 0.3 x 10 5 cells/cm2 ，制備濃度 1.1 x 10 5 cells/ml。將300 μl 的細(xì)胞懸浮液注入各孔中。將蓋子蓋在玻片上，在37°C和5% CO2中孵育。不需要進(jìn)一步添加培養(yǎng)基。

　　圖4：在ibiTreat μ-Slide 8 well(貨號(hào)：80826)中的RAW-264.7，播種后1小時(shí)

　　圖5: 在ibiTreat μ-Slide 8 well中的RAW-264.7，孵育24小時(shí)后

　　圖6：在ibiTreat μ-Slide 8 well中的RAW-264.7，經(jīng)過四天的培養(yǎng)

　　為獲得最佳的分布的勻的細(xì)胞，我們建議使用像μ-Slide VI 0.4 這樣的通道載玻片。在8孔腔室載玻片中，細(xì)胞密度可能會(huì)在孔的整個(gè)表面上因點(diǎn)而異，具體取決于細(xì)胞播種過程中的處理。

　　5. 免疫熒光染色

　　像往常一樣為您的細(xì)胞固定和染色。

　　注意：在 μ-Slides 中染色時(shí)注意液體的處理

　　μ-Slide VI 0.4 ：更換液體，先吸出兩個(gè)儲(chǔ)液池而不排空通道。 如果您使用的是真空設(shè)備，請(qǐng)注意不要將吸頭直接放在通道的入口上。 用100 μl新溶液沖洗通道3次。 從一側(cè)添加新的溶液，通過通道流入另一個(gè)儲(chǔ)液池，然后從另一側(cè)吸出，直到兩個(gè)儲(chǔ)液池都排空。注意通道永遠(yuǎn)不要干涸！

　　μ-Slide 8孔載玻片：在 μ-Slide 8孔中，無需特殊處理措施。像在任何其他培養(yǎng)皿或孔板中一樣的交換液體。

　　下文中，給出了使用以下材料對(duì)細(xì)胞核和肌動(dòng)蛋白絲進(jìn)行染色的示例：

　　細(xì)胞核：DAPI（Diamidino pheylindol dihydrochlorid） SIGMA, 32670 

　　肌動(dòng)蛋白絲：Phalloidin, Alexa Fluor ? 488 Conjugate, LONZA, PA-3010 

　　1. 用3.7% 的PFA在PBS（pH 7.4）中室溫下固定細(xì)胞10分鐘。

　　2. 用PBS清洗細(xì)胞三次。

　　3. 用Triton X 100（0.1%）孵育細(xì)胞5分鐘。

　　4. 用PBS清洗細(xì)胞三次。

　　5. 用1%牛血清白蛋白在PBS中孵育20分鐘。

　　6. 用PBS清洗細(xì)胞三次。

　　7. 在0.2μm濃度下用鬼筆環(huán)肽Alexa For 488孵育細(xì)胞20分鐘。

　　8. 用PBS清洗細(xì)胞三次。

　　9. 用DAPI（0.5μg/ml）孵育細(xì)胞10分鐘。

　　10. 用PBS清洗細(xì)胞三次。

　　11. 完全吸出通道并用ibidi封片劑重新填充。 現(xiàn)在樣品可在顯微鏡上觀察了。保存在陰暗陰涼處可儲(chǔ)存數(shù)周。

　　圖7：在 μ-Slide VI 0.4中的RAW-264.7用DAPI（細(xì)胞核、藍(lán)色）和Phalloidin, Alexa Fluor ? 488 Conjugate（肌動(dòng)蛋白絲，綠色）

　　1.介紹

　　本應(yīng)用逐步說明了如何串聯(lián)連接多個(gè)Luer-Slides。優(yōu)點(diǎn)是僅使用一個(gè)流體單元即可觀察和培養(yǎng)多個(gè)載玻片。當(dāng)使用相同規(guī)格的載玻片時(shí)，載玻片中的流速是相同的。也可以通過連接不同高度的載玻片來改變剪切速率（例如，μ-Slide I0.2Luer和μ-Slide I0.4Luer）。

　　本次介紹了兩個(gè)載玻片連接的過程。但是它可以應(yīng)用于大量的載玻片。

　　2.材料

　　載玻片：2片 μ-Slides I 0.6Luer, ibiTreat                ibidi (80186)

　　細(xì)胞：Endothelial cells (2.5 · 105 per slide)          e.g. Promocell

　　培養(yǎng)基：Endothelial Cell Growth Medium            e.g. Promocell

　　連接器：Serial Connector                                      ibidi (10830)

　　注射器：帶簡(jiǎn)單Luer適配器的無菌注射器（5 ml）

　　串行連接器：

　　管道：Silicone Tubing 1.6 mm ID                           ibidi (10842)

　　適配器：Luer Connector Male                                 ibidi (10824)

　　將一個(gè)塑料連接器插入通道載玻片的兩端（6厘米），以在載玻片之間連接起來。下圖是在兩端帶有兩個(gè)配套的Luer公接頭的連接器管?？捎靡掖蓟蚋邏簻缇窘宇^。

必須在無菌條件下執(zhí)行以下步驟！

　　3. 播種細(xì)胞

　　· 準(zhǔn)備1.67 · 106 cells/ml.的細(xì)胞懸液。

　　· 將150 μl注入通道。僅填充通道體積（圖1a）。

　　· 將帽蓋在Luer接頭上，并將載玻片放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)半小時(shí)來固定細(xì)胞。

　　· 細(xì)胞固定后，將兩邊儲(chǔ)液接口各加60 μl充滿。

　　4. 連接載玻片

　　現(xiàn)在準(zhǔn)備載玻片，使細(xì)胞在通道中生長(zhǎng)，并向儲(chǔ)液池中填充60 μl無細(xì)胞培養(yǎng)基（請(qǐng)參見第3節(jié)）。

　　· 在連接之前，將所有儲(chǔ)液器各加60 μl（圖1b）。

　　· 將連接器管的一個(gè)Luer適配器插入載玻片的一個(gè)母Luer適配器中（圖1c）。

　　· 將一些預(yù)備的培養(yǎng)基吸入注射器。倒轉(zhuǎn)注射器并將多余的空氣推出（圖1d）。

　　· 使用沒有氣泡的注射器在載玻片端口注入?？赡軙?huì)有些溢出（圖1e）。

　　小心地將液體注入載玻片，直到連接器管中充滿為止（圖1f）

　　圖1：（a）接種細(xì)胞時(shí)的用量； （b）載玻片在連接之前已完全填滿； （c）載玻片中插入連接管； （d）無氣泡的注射器； （e）將注射器插入載玻片一端； （f）用注射器推動(dòng)介質(zhì)來填充連接器管道

　　· 當(dāng)連接器管道完全充滿時(shí)（圖2a），將其插入第二張載玻片的接口上（圖2b-d）。

　　· 如果要連接兩個(gè)以上的載玻片，將第二個(gè)連接器管放在第二個(gè)載玻片空的另一端口上，用注射器推入介質(zhì)，依此類推。

　　· 慢慢連接的所有載玻片將注射器從適配器上卸下（圖2e）。

　　· 要將載玻片連接到灌注套件，兩個(gè)Luer容器必須在頂部填充培養(yǎng)基?？捎眉埥聿寥ミ^多的培養(yǎng)基。

　　圖2：（a）連接管已完全充滿； （b-c）將連接器管插入第二載玻片的魯爾接頭上； （d）帶有適配接頭管連接； （e）取下注射器； （f）擦去溢出的介質(zhì)，并填充儲(chǔ)液罐以連接到灌注套件。

　　5. 連接到灌注裝置

　　將載玻片連接到灌注套件

　　圖片串聯(lián)安裝帶有兩個(gè)μ-Slides I Luer的一個(gè)流體單元