參與評(píng)論

評(píng)論

登錄后參與評(píng)論

全部評(píng)論(1條)

• 

  zhuoyue234 2010-12-30 00:00:00

  原核表達(dá)系統(tǒng) 表達(dá)調(diào)控方式 組成型，誘導(dǎo)型 表達(dá)產(chǎn)物定位 分泌型，不分泌型(細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞膜，周質(zhì)空間) 產(chǎn)物純化方式 是否融合蛋白，是否一步親和純化 產(chǎn)物溶解狀況 可溶，包含體，分泌型 在各種表達(dá)系統(tǒng)中，Z早被采用進(jìn)行研究的是原核表達(dá)系統(tǒng)，這也是目前掌握Z(yǔ)為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。該項(xiàng)技術(shù)的主要方法是將已克隆入目的基因DNA片段的載體(一般為質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化細(xì)菌(通常選用的是大腸桿菌)，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)并Z終純化獲得所需的目的蛋白。其優(yōu)點(diǎn)在于能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物，而且所需的成本相對(duì)比較低廉。但與此同時(shí)原核表達(dá)系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點(diǎn)：如通常使用的表達(dá)系統(tǒng)無(wú)法對(duì)表達(dá)時(shí)間及表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，有些基因的持續(xù)表達(dá)可能會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，過(guò)量表達(dá)可能導(dǎo)致非生理反應(yīng)，目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難；而且原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低 為克服上述不足，許多學(xué)者將原核基因調(diào)控系統(tǒng)引入真核基因調(diào)控領(lǐng)域，其優(yōu)點(diǎn)是 ①根據(jù)原核生物蛋白與靶DNA間作用的高度特異性設(shè)計(jì)，而靶DNA與真核基因調(diào)控序列基本無(wú)同源性，故不存在基因的非特異性激活或YZ ②能誘導(dǎo)基因GX表達(dá)，可達(dá)105倍，為其他系統(tǒng)所不及； ③能?chē)?yán)格調(diào)控基因表達(dá)，即不僅可控制基因表達(dá)的“開(kāi)關(guān)”，還可人為地調(diào)控基因表達(dá)量 因此，利用真核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)目的蛋白越來(lái)越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。 2RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無(wú)論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無(wú)RNA酶和基因組DNA的污染。 RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。。RT-PCR用于對(duì)表達(dá)信息進(jìn)行檢測(cè)或定量。另外，這項(xiàng)技術(shù)還可以用來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)差異或不必構(gòu)建cDNA文庫(kù)克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機(jī)引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在Z佳條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時(shí)為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進(jìn)行。 逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴(lài)RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性： 1、 依賴(lài)RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNAdiyi條鏈 2、 Rnase水解活性：水解RNA雜合體中的RNA 3、 依賴(lài)DNA的DNA聚合酶活性：以diyi條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA 用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇隨機(jī)引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。對(duì)于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA，三種都可。 實(shí)驗(yàn)方法如下 http://show.bioon.com/protocol/smallclass.asp?typeid=1724&newstype=RT-PCR 3 質(zhì)粒是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器和細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(DNA)分子。現(xiàn)在習(xí)慣上用來(lái)專(zhuān)指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。許多細(xì)菌除了染色體外，還有大量很小的環(huán)狀DNA分子，這就是質(zhì)粒(plasmid)（補(bǔ)充：部分質(zhì)粒為RNA）。質(zhì)粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質(zhì)粒稱(chēng)為附加體(episome)，這類(lèi)質(zhì)粒能夠整合進(jìn)細(xì)菌的染色體，也能從整合位置上切離下來(lái)成為游離于染色體外的DNA分子。 目前，已發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的細(xì)菌有幾百種，已知的絕大多數(shù)的細(xì)菌質(zhì)粒都是閉合環(huán)狀DNA分子(簡(jiǎn)稱(chēng)cccDNA)。細(xì)菌質(zhì)粒的相對(duì)分子質(zhì)量一般較小，約為細(xì)菌染色體的0.5%～3%。根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，大致上可以把質(zhì)粒分成大小兩類(lèi)：較大一類(lèi)的相對(duì)分子質(zhì)量是40×106以上，較小一類(lèi)的相對(duì)分子質(zhì)量是10×106以下(少數(shù)質(zhì)粒的相對(duì)分子質(zhì)量介于兩者之間)。每個(gè)細(xì)胞中的質(zhì)粒數(shù)主要決定于質(zhì)粒本身的復(fù)制特性。按照復(fù)制性質(zhì)，可以把質(zhì)粒分為兩類(lèi)：一類(lèi)是嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時(shí)，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有1～2個(gè)質(zhì)粒；另一類(lèi)是松弛型質(zhì)粒，當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個(gè)細(xì)胞內(nèi)一般有20個(gè)左右質(zhì)粒。一般分子量較大的質(zhì)粒屬?lài)?yán)緊型。分子量較小的質(zhì)粒屬松弛型。質(zhì)粒的復(fù)制有時(shí)和它們的宿主細(xì)胞有關(guān)，某些質(zhì)粒在大腸桿菌內(nèi)的復(fù)制屬?lài)?yán)緊型，而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。 在基因工程中，常用人工構(gòu)建的質(zhì)粒作為載體。人工構(gòu)建的質(zhì)?？梢约喾N有用的特征于一體，如含多種單一酶切位點(diǎn)、抗生素耐藥性等。常用的人工質(zhì)粒運(yùn)載體有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四環(huán)素基因(Tcr)和抗氨芐青霉素基因(Apr)，并含有5種內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)。如果將DNA片段插入EcoRI切點(diǎn)，不會(huì)影響兩個(gè)抗生素基因的表達(dá)。但是如果將DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或 Sal I切點(diǎn)，就會(huì)使抗四環(huán)素基因失活。這時(shí)，含有DNA插入片段的pBR322將使宿主細(xì)菌抗氨芐青霉素，但對(duì)四環(huán)素敏感。沒(méi)有DNA插入片段的pBR322會(huì)使宿主細(xì)菌既抗氨芐青霉素又抗四環(huán)素，而沒(méi)有pBR322質(zhì)粒的細(xì)菌將對(duì)氨芐青霉素和四環(huán)素都敏感。pSC101與pBR322相似，只是沒(méi)有抗氨芐青霉素基因和PstI切點(diǎn)。質(zhì)粒運(yùn)載體的Z大插入片段約為10 kb(kb表示為千堿基對(duì))。 4 基因診斷（gene diagnosis）是以探測(cè)基因的存在，分析基因的類(lèi)型和缺陷及其表達(dá)功能是否正常，從而達(dá)到診斷疾病的一種方法。它是繼形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)診斷之后的第四代診斷技術(shù)，它的誕生與發(fā)展得益于分子生物學(xué)理論和技術(shù)的迅速發(fā)展。 常用基因診斷技術(shù)： 一、Southern印跡法（Southern blot） 基本原理是：硝酸纖維膜或尼龍濾膜對(duì)單鏈DNA的吸附能力很強(qiáng)，當(dāng)電泳后凝膠經(jīng)過(guò)DNA變性處理，覆以上述濾膜，再于其上方壓上多層干燥的吸水紙，借助它對(duì)深鹽溶液的上吸作用，凝膠上的單鏈DNA將轉(zhuǎn)移到濾膜上。轉(zhuǎn)移是原位的，即DNA片段的位置保持不變。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，經(jīng)過(guò)80℃烘烤的DNA，將原位地固定于膜上。 當(dāng)含有特定基因片段已原位轉(zhuǎn)移到膜上后，即可與同位素標(biāo)記了的探針進(jìn)行雜交，并將雜交的信號(hào)顯示出來(lái)。雜交通常在塑料袋中進(jìn)行，袋內(nèi)放置上述雜交濾膜，加入含有變性后探針的雜交溶液后，在一定溫度下讓單鏈探針DNA與固定于膜上的單鏈基因DNA分子按堿基到互補(bǔ)原理充分結(jié)合。結(jié)合是特異的，例如只有β珠蛋白基因DNA才能結(jié)合上β珠蛋白的探針。雜交后，洗去膜上的未組合的探針，將Ⅹ線膠片覆于膜上，在暗盒中日光進(jìn)行放射自顯影。結(jié)合了同位素標(biāo)記探針的DNA片段所在部位將顯示黑色的雜交帶，基因的缺失或突變則可能導(dǎo)致帶的缺失或位置改變。 二、聚合酶鏈反應(yīng) 近年來(lái)，基因分析和基因工程技術(shù)有了革命性的突破，這主要?dú)w功于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的發(fā)展和應(yīng)用。應(yīng)用PCR技術(shù)可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小時(shí)內(nèi)體外擴(kuò)增數(shù)十萬(wàn)至百萬(wàn)倍。擴(kuò)增的片段可以直接通過(guò)電泳觀察，也可用于進(jìn)一步的分析。這樣，少量的單拷貝基因不需通過(guò)同位素提高其敏感性來(lái)觀察，而通過(guò)擴(kuò)增至百萬(wàn)倍后直接觀察到，而且原先需要一、二周才能作出的診斷可以縮短至數(shù)小時(shí)。 三、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA的長(zhǎng)度多態(tài)性可以通過(guò)PCR擴(kuò)增后電泳來(lái)檢出，并用于致病基因的連鎖分析，這種診斷方法稱(chēng)為擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，Amp-FLP）連鎖分析法。PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物即等位片段之間的差別有時(shí)只有幾個(gè)核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定。此法多用于突變性質(zhì)不明的連鎖分析. 四、等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法 當(dāng)基因的突變部位和性質(zhì)已完全明了時(shí)，可以合成等基因特異的寡核苷酸探針（allele-specific oligonucleotide，ASO）用同位素或非同位素標(biāo)記進(jìn)行診斷。探針通常為長(zhǎng)20bp左右的核苷酸。用于探測(cè)點(diǎn)突變時(shí)一般需要合成兩種探針，與正?；蛐蛄型耆恢?，能與之穩(wěn)定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩(wěn)定雜交，但不能與正?；蛐蛄蟹€(wěn)定雜交，這樣，就可以把只有一個(gè)堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開(kāi)來(lái). PCR可結(jié)合ASO，即PCR－ASO技術(shù)，即先將含有突變點(diǎn)的基因有關(guān)片段進(jìn)行體外擴(kuò)增，然后再與ASO探針作點(diǎn)雜交，這樣大大簡(jiǎn)化了方法，節(jié)約了時(shí)間，而且只要極少量的基因組DNA就可進(jìn)行。 五、單鏈構(gòu)象多態(tài)性診斷法 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（signle strand conformation polymorphism，SSCP）是指單鏈DNA由于堿基序列的不同可引起構(gòu)象差異，這種差異將造成相同或相近長(zhǎng)度的單鏈DNA電泳遷移率不同，從而可用于DNA中單個(gè)堿基的替代、微小的缺失或手稿的檢測(cè)。用SSCP法檢查基因突變時(shí)，通常在疑有突變的DNA片段附近設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增物用甲酰胺等變性，并在聚丙烯酰胺凝膠中電泳，突變所引起的DNA構(gòu)象差異將表現(xiàn)為電泳帶位置的差異，從而可據(jù)之作出診斷。

  贊(12)

  回復(fù)(0)

  評(píng)論

  評(píng)論

  登錄后參與評(píng)論