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  夕郭喝 2013-11-05 00:00:00

  [編輯本段]蛋白質組學的研究內容 主要有兩方面，一是結構蛋白質組學，二是功能蛋白質組學。其研究前沿大致分為三個方面： ① 針對有關基因組或轉錄組數(shù)據(jù)庫的生物體或組織細胞，建立其蛋白質組或亞蛋白質組及其蛋白質組連鎖群，即組成性蛋白質組學。 ② 以重要生命過程或人類重大疾病為對象，進行重要生理病理體系或過程的局部蛋白質組或比較蛋白質組學。 ③ 通過多種先進技術研究蛋白質之間的相互作用，繪制某個體系的蛋白，即相互作用蛋白質組學，又稱為“細胞圖譜”蛋白質組學。 此外，隨著蛋白質組學研究的深入，又出現(xiàn)了一些新的研究方向，如亞細胞蛋白質組學、定量蛋白質組學等。 [編輯本段]蛋白質組學研究中的主要技術 1 雙向凝膠電泳技術(2-DE) 雙向凝膠電泳技術與質譜技術是目前應用Z為廣泛的研究蛋白質組學的方法。雙向凝膠電泳技術利用蛋白質的等電點和分子量差別將各種蛋白質區(qū)分開來。雖然二維凝膠電泳難以辨別低豐度蛋白，對操作要求也較高，但其通量高、分辨率和重復性好以及可與質譜聯(lián)用的特點，使其成為目前Z流行、可靠的蛋白質組研究手段。雙向凝膠電泳技術及質譜基礎的蛋白質組學研究程序為樣品制備→等電聚焦→聚丙烯酰胺凝膠電泳→凝膠染色→挖取感興趣的蛋白質點→膠內酶切→質譜分析確定肽指紋圖譜或部分氨基酸序列→利用數(shù)據(jù)庫確定蛋白。蛋白質組研究要求有高分辨率的蛋白質分離及準確、靈敏的質譜鑒定技術。凝膠電泳中蛋白質的著色不僅影響蛋白質分離的分辨率，同時也影響后續(xù)的質譜鑒定。蛋白質的染色可分為有機試劑染色、銀染、熒光染色及同位素顯色四類。 Unlu 等提出了一種熒光差異顯示雙向電泳(F-2D-DIGE)的定量蛋白質組學分析方法。差異凝膠電泳(DIGE)是對2-DE 在技術上的改進，結合了多重熒光分析的方法，在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒光標記的樣品，并diyi次引入了內標的概念。兩種樣品中的蛋白質采用不同的熒光標記后混合，進行2-DE，用來檢測蛋白質在兩種樣品中表達情況，極大地提高了結果的準確性、可靠性和可重復性。在DIGE技術中，每個蛋白點都有它自己的內標，并且軟件可全自動根據(jù)每個蛋白點的內標對其表達量進行校準，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實的。DIGE 技術已經(jīng)在各種樣品中得到應用。 2 GX液相色譜技術(HPLC) 盡管二維凝膠電泳（2-DE）是目前常用的對全蛋白組的分析方法，但其存在分離能力有限、存在歧視效應、操作程序復雜等缺陷。對于分析動態(tài)范圍大、低豐度以及疏水性蛋白質的研究往往很難得到滿意的結果。Chong 等使用HPLC/ 質譜比較分析惡性腫瘤前和癌癥兩種蛋白質差異表達。利用HPLC 分離蛋白質，并用MALDI-TOF-MS 鑒定收集的組分，從而在兩種細胞中的差異表達中對蛋白質進行定量分析。多維液相色譜作為一種新型分離技術，不存在相對分子質量和等電點的限制，通過不同模式的組合，消除了二維凝膠電泳的歧視效應，具有峰容量高、便于自動化等特點。二維離子交換- 反相色譜(2D-IEC-RPLC)是蛋白質組學研究中Z常用的多維液相色譜分離系統(tǒng)。 3 表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜(SEL-DI)技術 表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜技術于2002 年由諾貝爾化學獎得主田中發(fā)明，剛剛產(chǎn)生便引起學術界的高度重視。SELDI 技術是目前蛋白質組學研究中比較理想的技術平臺，其全稱是表面增強激光解吸電離飛行時間質譜技術(SELDI-tof)。其方法主要如下：通常情況下將樣品經(jīng)過簡單的預處理后直接滴加到表面經(jīng)過特殊修飾的芯片上，既可比較兩個樣品之間的差異蛋白，也可獲得樣品的蛋白質總覽。因此，在應用方面具有顯著優(yōu)勢。 SELDI 技術分析的樣品不需用液相色譜或氣相色譜預先純化，因此可用于分析復雜的生物樣品。SELDI 技術可以分析疏水性蛋白質，PI 過高或過低的蛋白質以及低分子質量的蛋白質( < 25 000) ，還可以發(fā)現(xiàn)在未經(jīng)處理的樣品中許多被掩蓋的低濃度蛋白質，增加發(fā)現(xiàn)生物標志物的機會。SELDI 技術只需少量樣品，在較短時間內就可以得到結果，且試驗重復性好，適合臨床診斷及大規(guī)模篩選與疾病相關的生物標志物，特別是它可直接檢測不經(jīng)處理的尿液、血液、腦脊液、關節(jié)腔滑液、支氣管洗出液、細胞裂解液和各種分泌物等， 從而可檢測到樣品中目標蛋白質的分子量、PI、糖基化位點、磷酸化位點等參數(shù)。 4 同位素標記親和標簽(ICAT)技術 同位素親和標簽技術是近年發(fā)展起來的一種用于蛋白質分離分析技術，此技術目前是蛋白質組研究技術中的核心技術之一。該技術用具有不同質量的同位素親和標簽( ICATs) 標記處于不同狀態(tài)下的細胞中的半胱氨酸，利用串聯(lián)質譜技術，對混合的樣品進行質譜分析。來自兩個樣品中的同一類蛋白質會形成易于辨識比較的兩個不同的峰形，能非常準確的比較出兩份樣品蛋白質表達水平的不同。ICAT 的好處在于它可以對混合樣品直接測試；能夠快速定性和定量鑒定低豐度蛋白質，尤其是膜蛋白等疏水性蛋白等；還可以快速找出重要功能蛋白質。 由于采用了一種全新的ICAT 試劑，同時結合了液相色譜和串聯(lián)質譜，因此不但明顯彌補了雙向電泳技術的不足，同時還使高通量、自動化蛋白質組分析更趨簡單、準確和快速，代表著蛋白質組分析技術的主要發(fā)展方向。針對磷酸化蛋白分析以及與固相技術相結合ICAT 技術本身又取得了許多有意義的進展，已形成ICA T 系列技術。用具有不同質量的同位素親和標簽( ICATs) 標記處于不同狀態(tài)下的細胞中的半胱氨酸，利用串聯(lián)質譜技術，可對混合的樣品進行質譜分析。 5 生物信息學 近年來，生物信息學在生命科學研究中起著越來越重要的作用。利用生物信息學對蛋白質組的各種數(shù)據(jù)進行處理和分析，也是蛋白質組研究的重要內容。生物信息學是蛋白質組學研究中不可缺少的一部分。生物信息學的發(fā)展，已不僅是單純的對基因組、蛋白質組數(shù)據(jù)的分析，而且可以對已知的或新的基因產(chǎn)物進行全面分析。在蛋白質組數(shù)據(jù)庫中儲存了有機體、組織或細胞所表達的全部蛋白質信息，通過用鼠標點擊雙向凝膠電泳圖譜上的蛋白質點就可獲得 如蛋白質鑒定結果、蛋白質的亞細胞定位、蛋白質在不同條件下的表達水平等信息。目前應用Z普遍的數(shù)據(jù)庫是NRDB 和dbEST 數(shù)據(jù)庫。

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