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  hdbdmxJicnsnZn 2016-06-19 22:43:01

  　　脲酶urease（水解酶）： 　　脲酶試驗(yàn)原理： 　　存在于大多數(shù)細(xì)菌、真菌和高等植物里。它是一種酰胺酶、能酶促有機(jī)物質(zhì)分子中酶鍵的水解。脲酶的作用是極為專性的，它僅能水解尿素，水解的Z終產(chǎn)物是氨和碳酸。土壤脲酶活性，與土壤的微生物數(shù)量、有機(jī)物質(zhì)含量、全氮和SX磷含量呈正相關(guān)。根際土壤脲酶活性較高，中性土壤脲酶活性大于堿性土壤。人們常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素狀況。 　　土壤中脲酶活性的測(cè)定是以脲素為基質(zhì)經(jīng)酶促反應(yīng)后測(cè)定生成的氨量，也可以通過(guò)測(cè)定未水解的尿素量來(lái)求得。本方法是測(cè)定生成的氨量。 　　試劑：1）甲苯 　　2）10%尿素：稱取10g尿素，用水溶至100ml。 　　3）檸檬酸鹽緩沖液（PH6.7）：184克檸檬酸和147.5克氫氧化鉀溶于蒸餾水。將兩溶液合并，用1mol/LNaOH將PH調(diào)至6.7，用水稀釋至1000毫升。 　　4）苯酚鈉溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀釋至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。將AB溶液保存在冰箱中。使用前將2溶液各20毫升混合，用蒸餾水稀釋至100毫升。 　　5）次氯酸鈉溶液：用水稀釋試劑，至活性氯的濃度為0.9%，溶液穩(wěn)定。 　　6）氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液：a 精確稱取0.4717克硫酸銨溶于水并稀釋至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的標(biāo)準(zhǔn)液 　　標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：吸取配置好的氮溶液10ml，定容至100ml，即稀釋了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13ml移至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml苯酚鈉，仔細(xì)混合，加入3ml次氯酸鈉，充分搖蕩，放置20分鐘，用水稀釋至刻度。將著色液在紫外分光光度計(jì)上于578nm處進(jìn)行比色測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以光密度值為縱坐標(biāo)繪制曲線圖。 　　取新鮮土壤7份，每份30g，裝于棕色廣口瓶中，先將1，3－二氯丙烯溶于丙酮（定量），6份分別加入不同濃度均為1.5ml的1，3－二氯丙烯，使之在土壤中的濃度分別為1、10、50、100、200、500µg/g，另1份相應(yīng)加入1.5ml的丙酮作為對(duì)照，然后調(diào)節(jié)土壤的含水量至Z大田間持水量的60%（記錄此時(shí)重量，以便補(bǔ)充水分）。放置于25℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)后第0d、1d，5d，10d（前10d密封，后來(lái)測(cè)定的敞口）、20d，30d，40d，50d分別取土樣檢測(cè)脲酶的活性。取樣前，反復(fù)旋轉(zhuǎn)廣口瓶，混勻土樣，一個(gè)處理隨機(jī)取3個(gè)重復(fù)。 　　1) 稱取5g過(guò)1mm篩的風(fēng)干土樣于100ml容量瓶中。 　　2) 向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土樣濕潤(rùn)為度）并放置15分鐘 　　3) 之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml檸檬酸緩沖液（PH6.7），并 仔細(xì)混合 　　4) 將容量瓶放入37攝氏度恒溫箱中，培養(yǎng)24h 　　5) 培養(yǎng)結(jié)束后，用熱至38攝氏度水稀釋至刻度，仔細(xì)搖蕩，并將懸液用致密濾紙過(guò)濾于三角瓶中。 　　6) 顯色：吸取3ml濾液于50ml容量瓶中，加入10ml蒸餾水，充分震蕩，然后加入4ml苯酚鈉，仔細(xì)混合，再加入3ml次氯酸鈉，充分搖蕩，放置20分鐘，用水稀釋至刻度，溶液呈現(xiàn)（青定）酚的藍(lán)色。 　　7) 1h內(nèi)在（（青定）酚的藍(lán)色在1h內(nèi)保持穩(wěn)定）在分光光度計(jì)上用1cm液槽，于578nm處將顯色液進(jìn)行比色測(cè)定。 　　8) 無(wú)土對(duì)照：不加土樣，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同。以檢驗(yàn)試劑純度，整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)對(duì)照 　　9)無(wú)基質(zhì)對(duì)照：以等體積的水代替基質(zhì)，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同。每個(gè)土樣都設(shè)此對(duì)照。 　　結(jié)果計(jì)算：土壤脲酶活性以24小時(shí)后100g土壤中NH3－N的毫克數(shù)表示。 　　M＝（X樣品－X無(wú)土－X無(wú)基質(zhì)）*100*10 　　式中：M－土壤脲酶活性值 　　X樣品――樣品實(shí)驗(yàn)的光密度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的NH3－N毫克數(shù) 　　X無(wú)土――無(wú)土對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的光密度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的NH3－N毫克數(shù) 　　X無(wú)基質(zhì)――無(wú)基質(zhì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的光密度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的NH3－N毫克數(shù) 　　100 ――樣品定容的體積與測(cè)定時(shí)吸取量的比值 　　10 ――酶活性單位的土重與樣品土重之比值 　　注意事項(xiàng)：當(dāng)脲酶活性為3-80微克NH3-N時(shí)，本法能獲得可靠結(jié)果。當(dāng)脲酶活性小于3微克NH3-N，培養(yǎng)時(shí)間需增至24小時(shí)（已經(jīng)24h了）（計(jì)算時(shí)應(yīng)考慮這一點(diǎn)） 　　計(jì)算：脲酶活性以24h后1g土壤中NH3-N的mg數(shù)表示。 　　NH3-N（mg）＝a*2 　　A：從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得NH3-N毫克數(shù) 　　2 ：換算成1k土的系數(shù)。

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