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  hevdvjd 2011-03-11 00:00:00

  關(guān)于抽提質(zhì)粒： 1） 抽提質(zhì)粒時，加入 Solution II和 III后要求輕柔混勻。我個人覺得不用這樣，只要不是 非常劇烈，可以快速混勻。尤其可以運用在一次抽提多管質(zhì)粒的時候，這樣可以快速，而且 效果一點也不差。 2） 抽提質(zhì)粒時，用無水乙醇沉淀的時間可以由實驗操作者來決定，如果時間充裕可以 30 min，否則 8-10 min 也可以。至于溫度，個人覺得-20℃好于常溫。如果加入可醋酸鈉，會較 容易形成鹽類雜質(zhì)，所以時間短一些更好！ 3） 質(zhì)粒小提如果是用作鑒定或酶切，不必進行酚仿抽提，將溶液 1，2，3 離心后的清液移 入一個新的 1.5ml 離心管中，再次離心 3-5 min，小心取出上清液后，直接沉淀，不必擔(dān)心 DNA 切不開，我已經(jīng)這樣使用一年多，沒出過什么問題。當(dāng)然這樣的質(zhì)粒不很干凈，但是 做鑒定足夠了。尤其是實驗室女同胞們，可以減少酚仿的侵害，而且節(jié)省時間。 4）有時沉淀東西，由于沉淀量很少，離心完之后不知道到底有沒沉淀下來東西，由于量很 少，不好觀察，所以離心時建議按特定的方向放置離心管，這樣你就可以在離心之前確定沉 淀該沉淀到管子的大致部位，這樣離心后就可直接觀察那有沒有沉淀，避免滿管子找，另外 看沉淀時可以對光看，這樣就是顆粒狀的細小沉淀也能看見的，我覺得我們制備好了一批感 受態(tài)，Z好馬上轉(zhuǎn)化一種已知質(zhì)粒。與此同時，取一點感受態(tài)接種到含抗性的固/液體培養(yǎng) 基培養(yǎng)來做對照。這樣第二天即可以知道這批感受態(tài)是否還有外源質(zhì)粒，又可以知道這批感 受態(tài)轉(zhuǎn)化效率的高低。如果合格，那以后就可以放心使用！因為我也曾經(jīng)遇到其實是因為感 受態(tài)不好而導(dǎo)致試驗不成功，但是當(dāng)時不知道，結(jié)果費時費力。 5）提取質(zhì)粒的時候，Z后一步的酒精揮發(fā)很關(guān)鍵，基本上是其后續(xù)的酶切反應(yīng)的決定性因 素。所以這一步盡量揮發(fā)長一點時間，Z好是空調(diào)吹熱風(fēng)，或是 37℃溫箱放長一點的時間， 我試過室溫過夜，酶切很好。 6）在做克隆鑒定的時候經(jīng)常需要在酶切鑒定前進行 PCR 鑒定，每次配置 PCR 反應(yīng)液很繁 瑣，可以將其配置類似 Kit 的形式，按你需要的反應(yīng)體系列表，然后放大 100 倍配置 100× 主反應(yīng)液（100 次反應(yīng)），其中含 Buffer，Mg2＋，dNTPs，但不含引物和 Taq 酶，然后可以 10×分裝或一管儲存在-20℃，在需要的時候拿出融開，然后按所需的 PCR 反應(yīng)個數(shù)吸取相 應(yīng)的倍數(shù)，再補加相應(yīng)反應(yīng)倍數(shù)的 Taq 和引物，混勻后分裝，這樣做的好處如下： 1）節(jié)省 時間；2）避免每次反應(yīng)加樣不均的可能；3）大大減少 PCR假陽性的產(chǎn)生。

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