4月20日上午，徠卡與轉化醫(yī)學網(wǎng)共同舉辦了網(wǎng)絡研討會——“抽絲剝繭，超多重免疫標記解密腫瘤微環(huán)境之奧秘”。徠卡生命科學部的高級應用專員劉繼紅和Cell DIVE應用科學家Michael Smith為廣大觀眾揭示了CELL DIVE 超多重標記解決方案如何輕松應對復雜的腫瘤微環(huán)境，為臨床腫瘤的研究和治 療提供了優(yōu)秀的研究工具。Indica Labs應用科學家趙永田重 點介紹了在HALO中對獲取的Cell DIVE圖像的處理、分析步驟以及如何進行高緯的空間生物學分析，用以了解腫瘤微環(huán)境中腫瘤細胞和免疫細胞的相互作用關系對研究腫瘤免疫應答的作用機制。

01

CELL DIVE使用的抗體是開放的嗎？有大約多少種經(jīng)過驗證的抗體？

A：CELL DIVE 的抗體是開放的，有350種以上的抗體經(jīng)過驗證的抗體可以使用。

02

CELL DIVE可以在臨床上用嗎，是否有注冊證？

A：目前沒有注冊證，正在申請中。

03

這個平臺的檢測聯(lián)系哪位呢？

A：可以聯(lián)系Leica公司各地的應用支持和銷售。

04

這個染色是儀器自動染色嗎？

A：可以手動染色也可以和自動染色儀聯(lián)用自動染色。

05

哪個實驗室可以檢測？

A：Leica公司有DEMO機，可以提供一定的演示。

06

成像是全片還是一個視野？

A：成像儀可以選擇全片成像或者選取一個或多個視野成像。

07

怎樣避免非特異性染色 ？核陽性的和胞漿包膜可以隨意搭配嗎？

A：首先要選擇特異性好的抗體，我們抗體庫的抗體都是經(jīng)過驗證的抗體。

細胞核陽性和胞漿包膜理論上可以自由搭配。

08

每一輪染完了，除了染料失活，是不是還需要去除一抗？

A：每一輪染色成像完成，染料失活 不需要去除一抗。

09

CELL DIVE是不需要摸索一抗?jié)舛鹊膯?，固定的protocol會不會造成有的組織染不出來有的組織卻染色過強？

A：徠卡的protocol適用于絕大多數(shù)的組織，有些組織的某個marker 表達特別高或者特別低，可能需要修改抗體濃度。

10

抗體是什么方法學檢測標記？除了主講人介紹的熒光濾鏡，能否使用其他的熒光標記和濾鏡？

A：抗體驗證時參照同樣marker的免疫組化的結果；為了減少串色的發(fā)生，我們推薦使用Cy2、Cy3、Cy5、Cy7光譜基本相同的染料標記。

11

成像也是設備自動化進行的嗎？

A：成像時設備自動進行的，但是可以在拍照前根據(jù)樣本的染色情況進行優(yōu)化。

12

Did you find any nonspecific staining while utilizing the different CD markers for immune cells?（Michael Smith）

A：The Cell DIVE solution comes with a list of 350+ antibodies that have been validated for use with the workflow, and for specificity and sensitivity. For antibodies that are not used from the list, we provide details on a three part antibody validation process that also ensures that antibodies used are specific. In the case of residual nonspecific signal, this is likely removed by the autoflourescence imaging and removal of that signal that occurs at every round. So, in our hands, nonspecific staining is minimized at the level of antibody quality control and the image processing that the software performs.

13

關于細胞間鄰近距離的分析，我們如何設定所計算的距離范圍？

A：關于細胞間鄰近距離的分析，所定義距離的范圍目前還沒有相應的標準?？紤]到不同細胞亞型的相互作用，不同免疫細胞亞群之間鄰近距離的設定可能需要不同的標準。在分析中，HALO可以對距離進行設定，并按照不同的區(qū)間（例如0~5μm，5~10μm，10~15μm……）給出鄰近細胞的數(shù)量和密度。分析中先進行預分析，根據(jù)不同距離范圍內免疫細胞的密度和臨床信息進行相關性分析。再把確定的距離應用到所用的樣本切片中。

14

在分析過程中，我們可以選擇局部視野進行分析嗎？還是僅能對全組織切片進行分析？

A：分析中，我們建議針對全景組織切片進行分析，但HALO也可以定義ROI區(qū)域進行選擇性的視野進行分析。這兩種分析方法在HALO里都可以實現(xiàn)的。

本次網(wǎng)絡課程的第.一期在7月4日結束了，此次直播在講解知識的同時與大家進行了積極互動，并且收到了廣泛的好評。

鞠煥鑫博士講解的關于微區(qū)分析利器-SXI的使用秘笈，大家有沒有Get到呢？以下是本次網(wǎng)絡講堂的課件：

細胞因子是腫瘤微環(huán)境（Tumor Microenvironment,TME）中細胞通訊的關鍵介質，在癌癥的發(fā)生、發(fā)展、治 療和預后等多個方面發(fā)揮重要作用。在過去的 40 年中，細胞因子和細胞因子受體作為癌癥靶點或癌癥治 療方法得到了廣泛的研究。目前公認的臨床前治 療策略為增強干擾素和白細胞介素（包括 IL-2 ，IL-7 ，IL-12 和 IL-15 ）的生長抑 制和免疫刺激作用，或抑 制細胞因子（如 TNF ，IL-1β 和 IL-6 ）的炎癥和促進腫瘤的作用[1]。

圖 1 . 細胞因子在腫瘤微環(huán)境中的作用

特定細胞因子的表達也與腫瘤細胞的高存活率和高轉移性密切相關。其中促炎細胞因子 IL-6 和 IL-8 與多種癌癥相關，包括淋巴瘤、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和結腸直腸癌等 [2,3]。因此，分析細胞因子的表達是一種重要的診斷工具和預測癌癥預后的關鍵因素。

非放射性的 RNA 原位雜交技術（ViewRNA ISH）是一種高靈敏度的檢測細胞因子表達的有效方法，并且可以對 1 至 4 個 mRNA 目標進行多重分析。

檢測原理如下圖所示：

圖 2 .  ViewRNA ISH 檢測原理

安捷倫BioTek Cytation 5 多功能細胞成像微孔板檢測系統(tǒng)，可容納多達四個熒光通道同時成像，快速并出色地成多色熒光成像。儀器配備的高內涵分析軟件可自動計算細胞內 RNA 的表達水平。Cytation 5 活細胞成像工作站結合ViewRNA ISH，為細胞因子研究提供了一種高效率、高靈敏度和可重復的檢測方法。

實驗案例分享

 實驗一．細胞因子mRNA的成像和分析 

為研究細胞因子mRNA 在不同營養(yǎng)條件下的表達情況，設置兩組對照實驗。陽性對照細胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基中，而陰性對照細胞經(jīng)過 18 小時的血清饑餓處理。隨后加入 ViewRNA 探針以標記 IL-6 、IL-8 和 ACTB mRNA ，在Cytation 5 上分別使用 RFP 、GFP 、Cy5 和 DAPI 通道對探針進行成像完成 ISH 細胞分析。圖像結果表明：細胞因子mRNA 的表達在營養(yǎng)匱乏的條件下會顯著降低。

圖 3 . 陽性和陰性對照組成像。HCT116 放大 20 倍圖像作為（ A ）陽性對照和（ B ）陰性對照。MDA-MB-231 細胞放大 40 倍的圖像作為（ C ）陽性對照和（ D ）陰性對照。藍色：DAPI 染色的細胞核；綠色：標記 IL-8 mRNA ；橙色：標記 IL-6 mRNA ；紅色：標記 ACTB mRNA 。

接下來為了定量分析細胞因子表達，首先在 Cytation 5 的 DAPI 通道下進行細胞核計數(shù)，以確定每孔的細胞數(shù)量（圖 4A ）。然后分別在GFP 、RFP 通道進行細胞因子探針（ IL-6 或 IL-8 ）的熒光信號分析（圖 4B ）。通過細胞熒光信號的比率評估不同實驗條件下的細胞因子表達（圖 5 ）。

圖 4 . 每個細胞的熒光信號分析。( A ) 使用 Agilent-BioTek Gen5 軟件進行細胞分析圈選出 DAPI 標記的細胞核；( B ) 熒光標記的 IL-8 信號的圖像分析。

如圖 5 所示，使用 ViewRNA ISH 和 Cytation 5 這一組合準確的量化了細胞內 IL-6 和 IL-8 mRNA 的表達。

圖 5 . MDA-MB-231 細胞中 IL-8 表達和 HCT116 細胞中 IL-6 表達，并以細胞數(shù)目進行校正。

 實驗二．誘導細胞因子 mRNA 的表達 

使用不同劑量的 IL-1β 刺激 DU145 細胞，以分析細胞因子的 mRNA 的表達（圖6）。圖 7 結果顯示：雖然 IL-6 和 IL-8 的 mRNA 表達增加，但 IL-8 的表達變化更為顯著，這與先前研究結果一致[4]。IL-1β 的最 高劑量下，這兩種細胞因子的表達減少則是由于細胞毒性。這驗證了該檢測方法的可行性與穩(wěn)定性。

圖 6 . 不同濃度的 IL-1β 刺激下的 IL-6 、IL-8 和 ACTB 熒光 mRNA 探針信號 ( A ) 0 ng/mL；( B ) 0.02 ng/mL ；0.128 ng/mL；( D ) 0.8 ng/mL。藍色：DAPI染色的細胞核；綠色：標記的IL-8 mRNA；橙色：標記的 IL-6 mRNA ；紅色：標記的 ACTB mRNA 。

圖 7 . 不同濃度的 IL-1β 刺激下 DU145 細胞中 IL-6 和 IL-8 mRNA 的表達。

 實驗三．抑 制細胞因子 mRNA 的表達 

研究表明絲裂原活化蛋白激酶（ MAPK ）可調節(jié) IL-8 ，并證明用 MAPK/ERK 抑 制劑 U 0126 治 療可減少 DU145 和 MDA-MB-231 細胞中的炎癥細胞因子[4,5]。為了確認這一現(xiàn)象并驗證 ViewRNA ISH 和 Cytation 5 這一組合的能力，將不同濃度的 U 0126 加入到每種細胞類型中孵育 30 分鐘。然后用 1 ng/mL 的 IL-1β 刺激 DU145 細胞達 3 小時，而 MDA-MB-231 細胞未被刺激。使用 GFP 和 RFP 通道進行細胞計數(shù)和圖像分析以評估在 U 0126 治 療后 IL-8 和 IL-6 細胞因子 mRNA 的表達。采集的圖像（圖 8 ）和計算的熒光信號強度 （圖 9 ）證實了 U 0126 的抑 制作用。此外，也驗證了該方法的靈敏度，可以準確識別給予抑 制劑后 mRNA 的表達變化。

圖 8. U 0126 抑 制 IL-8 mRNA 的表達。圖像顯示了在不同濃度的 U 0126 處理后 ( A-E ) MDA-MB-231 細胞內 IL-6 、IL-8 和 ACTB 熒光 mRNA 探針信號；( F-J ) 為 DU145 細胞。藍色：DAPI 染色的細胞核；綠色：標記的 IL-8 mRNA ；橙色：標記的 IL-6 mRNA ；紅色：標記的 ACTB mRNA 。

圖 9 . U 0126 治療后 IL-8 和 IL-6 mRNA 在 MDA-MB-231 和 DU 145 細胞中的表達

結 語

ThermoFisher 的 ViewRNA ISH 細胞分析試劑盒和探針提供一種靈敏的方法來檢測 mRNA 表達。該方法在安捷倫BioTek Cytation 5 細胞成像系統(tǒng)的加持下得以更更快地采集多熒光通道的圖像，并更精 準的計算出每一個細胞的熒光信號強度。這種檢測、成像和分析的完 美結合提供了一種靈敏、靈活和高通量的方法用以檢測細胞因子 mRNA 的表達。

參考文獻：

[1] Propper DJ, Balkwill FR. Harnessing cytokines and chemokines for cancer therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2022 Apr;19(4):237-253.

[2] Kampan NC, Xiang SD, McNally OM, Stephens AN, Quinn MA, Plebanski M. Immunotherapeutic Interleukin-6 or Interleukin-6 Receptor Blockade in Cancer: Challenges and Opportunities. Curr Med Chem. 2018;25(36):4785-4806.

[3] Vecchi L, Mota STS, Zóia MAP, Martins IC, de Souza JB, Santos TG, Beserra AO, de Andrade VP, Goulart LR, Araújo TG. Interleukin-6 Signaling in Triple Negative Breast Cancer Cells Elicits the Annexin A1/Formyl Peptide Receptor 1 Axis and Affects the Tumor Microenvironment. Cells. 2022 May 20;11(10):1705.

[4] Kooijman R, Himpe E, Potikanond S, Coppens A. Regulation of interleukin-8 expression in human prostate cancer cells by insulin-like growth factor-I and inflammatory cytokines. Growth Horm IGF Res. 2007 Oct;17(5):383-91.

[5] Chelouche-Lev D, Miller CP, Tellez C, Ruiz M, Bar-Eli M, Price JE. Different signalling pathways regulate VEGF and IL-8 expression in breast cancer: implications for therapy. Eur J Cancer. 2004 Nov;40(16):2509-18. 

介紹和目標

免疫系統(tǒng)對癌癥治 療的反應可以反映患者在治 療之后是否會有良好的結果。了解腫瘤微環(huán)境（TME）在腫瘤發(fā)生和治 療反應中的變化對制定個性化的治 療方案并改善癌癥治 療至關重要。借助穩(wěn)定和全面的超多標成像技術，可使用免疫標志物探查髓系和淋巴系細胞的譜系和結構，而且結合特定腫瘤生物標志物時，還可以捕捉多種腫瘤中TME內的免疫反應。細胞類型特征模式，結合超多標組織成像的探查能力，可以針對免疫細胞群和TME內眾多類型細胞的空間相互作用提供之前無法獲得的全新認識。

Cell DVE超多標成像分析整體解決方案可以使用循環(huán)染色和染料失活流程對一個完整組織切片上的數(shù)十個生物標志物進行檢測和成像。Cell DIVE的核心是一個精確、靈活、開放的多標記成像解決方案，可以靈活選擇多標記成像研究中常用的生物標志物抗體。Cell Signaling Technology(CST)擁有豐富的經(jīng)IHC驗證的抗體組合，可檢測TME中的關鍵蛋白質，實現(xiàn)組織中的免疫細胞檢測和表型判斷。CST提供抗體偶聯(lián)物，這些偶聯(lián)物均經(jīng)過驗證，可用于Cell DIVE上，并提供經(jīng)IHC驗證抗體與熒光團和其他檢測試劑的定制化偶聯(lián)。CST采用嚴格的IHC驗證方法，隨后還會在Cell DIVE平臺上進行驗證，可確保成功檢測蛋白質。

在本研究中，我們展示了使用由數(shù)十種CST生物標志物抗體?組成的新型檢測模式，在多種組織類型中進行的Cell DIVE超多標成像。多標記檢測模式的開發(fā)所需的優(yōu)化極少，可識別復雜的細胞類型，并揭示腫瘤微環(huán)境中的細胞間相互作用。

結 果

表征腫瘤微環(huán)境有助于理解導致患者預后不佳的新機制。腫瘤微環(huán)境比較復雜，通常在單個樣本和不同患者樣本中都是異質的。循環(huán)多標記染色和成像可在不同組織樣本中實現(xiàn)TME探查，即使可用組織有限的情況下。在這項研究中，我們檢查了12個完整組織或TMA切片中30多個生物標志物的表達（表1），重 點是潛在的免疫治 療目標、預測性生物標志物和分割標志物。所有的CST生物標志物抗體均被連接并隨機分配到一個回合。

表1.研究設計：抗體和組織

為了在TME中其他細胞的背景下定義免疫細胞，融合并分割了所有的生物標志物圖像，并使用聚類分析和降維（UMAP）對表達進行分析。聚類分析提供了一個無偏見的方法來定義組織內的免疫細胞貢獻。

在這項研究中，我們展示了人類結腸腺癌（CAC；圖1）的聚類分析。在這里，聚類分析將白細胞從所有其他上皮細胞和基質細胞類型中區(qū)分出來（圖1C）。此外，聚類清楚地定義了淋巴細胞和骨 髓細胞類別。CAC中的骨 髓類亞型包括骨 髓祖細胞、M2巨噬細胞和另外兩個未知亞型的骨 髓聚類。其他生物標志物可用于進一步定義亞型。對于淋巴類，定義了T細胞和NKT細胞聚類。另外，還確定了一個具有CD20陽性的T細胞聚類。使用機器學習進行單細胞表型分析，可以從聚類中進一步定義細胞類型。例如，在圖像1D中，聚類15中的一個細胞是CD45+ CD3+ CD8+ CD4+ GRZB+ Ki67+ LAG3+ PD1+TIM3+（圖1D-E；橙色圈）。聚類和單細胞空間分析被應用于研究中的所有其他組織（圖2；數(shù)據(jù)未顯示）。

圖1：CST檢測模式的多標成像可在一張玻片上檢查結腸腺癌（CAC）組織的免疫細胞成分（圖1 A）。用多種生物標志物對玻片進行反復染色和成像（表1；圖1 A、B、D板）。使用全套30種生物標志物進行分割后，聚類分析顯示了組織內的免疫細胞（1C-H所示為CAC，正常結腸組織未顯示）。聚類15（圖1D-F）被突出顯示，一個跨生物標志物的特定細胞用一個橙色的圓圈突出顯示（圖1D）。降維（UMAP；圖1G）表示免疫細胞和其他聚類之間的關系。

圖2：CST檢測模式在多種癌癥和正常組織類型中的多標成像。玻片被反復染色和成像（表1；圖2組織類型）。所有生物標志物顯示在一張圖像中。使用全套30種生物標志物進行分割后，聚類分析顯示了組織內的免疫細胞（數(shù)據(jù)未顯示）。組織特定的免疫細胞聚類是由特定的生物標志物表達模式統(tǒng)計出來的。在聚類之后，單細胞表型能夠對聚類中的細胞群進行空間分析。

方法和材料

CST抗體經(jīng)過了嚴格的驗證，以確?？贵w在FFPE組織上的表現(xiàn)。本研究中的所有抗體都是直接偶聯(lián)或商業(yè)偶聯(lián)物成品（表1）。偶聯(lián)是使用非位點特異性化學方法進行的?？贵w與四種不同的染料過量偶聯(lián)，去除未結合的染料，并通過分光光度分析測量標記的程度。經(jīng)過初步驗證，具有最 佳標記程度和濃度的偶聯(lián)抗體溶液隨后用于對各種人類癌癥組織和正常組織的染色。組織從商業(yè)來源獲得（Pantomics；表1）。在Cell DIVE上使用四通道+DAPI對組織進行成像，并自動進行自發(fā)熒光去除、校正和拼接。使用徠卡顯微系統(tǒng)開發(fā)的專 利軟件全拼接圖像進行導入、融合和分析。

結 論

• 使用Cell DIVE超多標組織成像分析整體解決方案，用30多種CST生物標志物抗體對12個完整的組織和TMA切片進行循環(huán)染色和成像。

•  這個CST檢測模式能夠識別含有不同免疫類別、細胞類型和亞型的細胞的集群。

• Cell DIVE超多標組織成像分析整體解決方案可保存組織，未來進一步定義免疫細胞亞型的工作可以繼續(xù)使用同一組織切片上的其他CST抗體，并與研究中所有先前的生物標志物疊加。

相關產(chǎn)品

超多標組織成像分析整體解決方案Cell DIVE

11月4日，瑞沃德“沃”在前沿·免疫治療專家論壇直播圓滿落幕！本期論壇有幸邀請到3位專家做客瑞沃德直播間，期間老師們不僅針對腫瘤免疫治療的相關內容進行了分享，同時圍繞腫瘤免疫治療新方向展開精彩討論，在線觀看人次3000+，共同探討免疫治療在腫瘤領域的最 新進展及發(fā)展趨勢。

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繼3月3日學習了新發(fā)布36項獸藥殘留之喹諾酮類的檢測方法后，3月10日小伙伴們又如約來到壇墨直播間，聆聽四環(huán)素類藥物殘留的檢測關鍵點：

首先，秦老師帶領大家分析了四環(huán)素類獸藥的結構特點：

接著對比了四環(huán)素類相關檢測標準在適用范圍，提取溶劑，凈化柱等方面的區(qū)別；最后重點介紹了新國標GB 31656.11和GB 31658.6兩個標準前處理過程中需要注意的關鍵細節(jié)。

新發(fā)布36項獸藥殘留檢測標準解讀系列（三）

課題

新發(fā)布36項獸藥殘留檢測標準解讀系列（三）

直播間的小伙伴們都非常的積極，紛紛提出自己檢測過程中遇到的問題，秦老師一一給與了詳細的解答。

Q1: 配制四環(huán)素類標準品時的注意事項？

儲存條件和保質期？

A: 由于四環(huán)素類獸藥的熱穩(wěn)定性較差，見光易分解；建議不要配制太高濃度，防止析出；配制100 μg/mL標準儲備液, -18℃ 以下避光保存，有效期1個月；混合標準工作液，2℃~8℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

Q2：樣品前處理中加入乙腈后，樣品成團，

能均質嗎？如何避免成團？

A: 樣品成團是因為蛋白質遇到有機溶劑變性所致；建議加入適量純水，使樣品形成糊狀，然后再均質；后續(xù)的除水可以通過加入氯化鈉或者無水硫酸鎂進行鹽析去除。

Q3: GB 31656.11四環(huán)素類測定，

加入醋酸鉛后，依然難過柱，

如何更好地解決？

A: 重點是樣品提取過程中把蛋白等雜質去除干凈，需要充分地離心；建議離心時間稍微長一點，低溫高速多次離心，快速過濾。

聽完秦老師的技術分享，小伙伴們對壇墨產(chǎn)品的呼聲也很高，研發(fā)張金龍經(jīng)理對配套標準品進行了一一講解，并給出了直播間最優(yōu)的折扣。

如果還有疑問的同學可以在本條公眾號下留言。感謝大家的參與，持續(xù)關注我們，下期再見喲~