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  苦尋* 2010-06-28 00:00:00

  　　離子交換層析 　　Tina 發(fā)表于 2006-2-21 12:21:00 　　材料與儀器 　　DEAE-32纖維素，pH8.0 0.01 mol/L Tris-HCl，工程菌破碎離心后的上清液； 　　層析柱 　　二、 方法與步驟 　　1） 裝柱： 　　用水清洗層析柱，柱內(nèi)留存水距底部約1cm，加入18ml介質(zhì)（凝膠溶液）。 　　2） 平衡： 　　加0.01M，PH8.0，tris-HCl緩沖液，直至流出液PH與緩沖液一致。 　　3） 上樣： 　　用量筒量出上清液體積，再加入等體積緩沖液混合，取EP管留1.5ml。待柱中水流出，至剛好覆蓋凝膠表面，靠璧緩慢加樣。 　　4) 用50ml緩沖液洗滌，用EP管隨機收集樣品穿出液和洗滌穿出液。 　　5) 洗脫： 　　將梯度洗滌儀和層析柱連接，洗脫瓶A（混合器）加200µl緩沖液，開口打開至兩瓶液面相平，相通管道出無氣泡，關(guān)閉連接，A中加入6gNaCl溶解，把裝置放在梯度混合儀上，開動攪拌器開關(guān)，打開A和B的連接通道，層析柱下端連收集器，收集洗脫流出液。 　　6） 控制流速，約4min/管，2-3ml/管。 　　分子篩的是凝膠層析 　　Sephadex G-100凝膠層析 　　Tina 發(fā)表于 2006-2-21 12:27:00 　　材料與儀器 　　Sephadex G-100，0.5 mol/L pH8.0 Tris-HCl，濃縮液 　　層析柱 　　二、 方法與步驟 　　1） Sephadex G-100 凝膠預(yù)處理 　　a) 100ml燒杯，稱取5克sephadex G-100，加入50ml去離子水，浸泡溶脹24小時。 　　b) 傾去sephadex G-100溶脹后凝膠上層的水，加入凝膠等體積的1.0 mol/L NaOH液處理，用攪棒輕輕攪動，并浸泡1小時處理后傾去。用去離子水洗滌。洗滌過程中，用傾去法除去細(xì)顆粒。其方法是用攪棒將凝膠攪勻（注意不要過分用力攪拌，以防止顆粒破碎），放置數(shù)分鐘，將未沉淀的細(xì)顆粒隨上層水倒掉。浮選3-5次，直至上層沒有細(xì)顆粒為止，再浸泡水洗至PH中性。 　　c) 將Sephadex G-100凝膠水溶液盛放于抽濾瓶中，用洗耳球塞住杯口，減壓抽氣30分鐘，除去凝膠溶液內(nèi)的氣泡，將脫氣后的凝膠溶液輕輕倒入燒杯中，其中盛有1/2去離子水。 　　2) 裝柱 　　a) 層析柱(1.0Î50cm)用水清洗干凈，柱的上、下端聯(lián)接塑料管接上小乳膠管，裝上螺旋夾。將層析柱垂直裝好。校直過程用下端綁有鑰匙的繩子掛于鐵架的不同位置，從多角度校正使柱垂直。打開柱上端口，從柱底下出口管朝柱內(nèi)注入水，使柱底全部充滿水而不留氣泡，關(guān)閉柱出口。Z終柱內(nèi)留存有2 cm的水。從出口處接上一根直徑2 mm細(xì)塑管，塑管另一端固定在柱的上端部位。 　　b) 攪動凝膠溶液（切勿攪動太快，以免空氣再逸入），使形成均一的薄膠漿，并立即沿玻棒倒入層析管內(nèi)，讓加入的凝膠在柱內(nèi)自然沉降，待柱底面上積起約1-2 cm的凝膠床后，打開柱出口水流。隨著柱內(nèi)水的流出，上面不斷加入凝膠液，使形成的凝膠床面上有凝膠連續(xù)下降（如果凝膠床面上不再有凝膠顆粒下降，應(yīng)該用攪棒均勻地將凝膠床攪起數(shù)厘米高，然后再加凝膠，不然就會形成界面，影響層析效果）。 　　c) 凝膠沉積到柱內(nèi)凝膠是否均勻，有否“紋路”或氣泡。若層析柱不均一，必須重新裝柱。 　　3） 平衡 　　柱裝好后，使層析床穩(wěn)定15-20分鐘，然后連接洗脫瓶出口和層析柱頂端，用3-5倍體積地緩沖液平衡層析柱。平衡過程中控制上柱緩沖液地進柱操作壓保持恒定。保持流速每滴/10秒。直至流出液的PH與上柱緩沖液完全相同。 　　4） 樣品洗脫 　　a) 上樣準(zhǔn)備： 　　i) 上樣前打開層析柱上端，先檢查凝膠床界面是否平整，如果傾斜不平整，可用玻棒將凝膠床界面輕輕攪起后，再使凝膠自然沉降，形成平整狀態(tài)的凝膠床界面。用毛細(xì)吸管小心吸去大部分清液，然后讓液面自然下降，直至幾乎露出凝膠床界面。 　　ii) 樣品放入高速離心機，12000r/min、離心5 min。 　　iii) 上樣前吸取50µl樣品于EP管中，以備走電泳。 　　b) 樣品上樣： 　　i) 將樣品由玻棒引流沿管壁加入到凝膠床面上，注意不要將床面凝膠沖起。同時打開層析柱下面流出液開關(guān)（控制流速1滴/20秒），保持層析柱下面流出滴速與上樣的滴速一致，控制凝膠床界面不能脫水，并控制樣品區(qū)帶盡量狹窄。 　　ii) 當(dāng)1.5ml樣品全部加入后，用 1-2 ml的0.5mol/L PH8.0 Tris-HCl洗脫液同上樣時一樣地保持層析柱下面流出滴速與上樣的滴速一致以控制凝膠床界面不能脫水，小心清洗凝膠床界面表面，使黏附著的樣品全部洗入凝膠床。 　　iii) 然后開始控制上樣的滴速大于層析柱下面流出滴速，使幾乎與凝膠床界面相平的洗脫液液面慢慢提高至凝膠床界面高出2cm左右，封閉層析柱上端。 　　iv) 保持層析柱上柱洗脫液入口處與層析柱下面流出處有一定勢壓?？刂粕现彌_液的進柱操作壓保持恒定。 　　c) 洗脫： 　　用0.1 mol/L PH8.0 Tris-HCl 緩沖液洗脫，用部分收集器收集，4分鐘/管（約2-3ml/管），收集約1-30管。 　　5） 酶活、酶濃度測定，參見2.6.2，2.6.3 　　6） Z高酶活收集管洗脫液留50µl，以備走電泳。 　　7） 將酶活較高的收集液10~14管合并，測定總體積為7.1 ml，精確測定酶活性。并用考馬思亮藍測定蛋白濃度。測酶活時體系稀釋了200倍，定蛋白時無稀釋。

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