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  高冷專用 2018-03-03 00:00:00

  組織培養(yǎng)的方法和步驟 要根據(jù)培養(yǎng)目的適當選取材料，選擇原則：易于誘導、帶菌少。要選取植物組織內(nèi)部無菌的材料。這一方面要從健壯的植株上取材料，不要取有傷口的或有病蟲的材料。另一方面要在晴天，Z好是中午或下午取材料，決不要在雨天、陰天或露水未干時取材料。因為健壯的植株和晴天光合呼吸旺盛的組織，有自身消毒作用，這種組織一般是無菌的。培養(yǎng)材料的消毒 從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶人培養(yǎng)基，便會造成培養(yǎng)基污染。因此，植物材料必須經(jīng)嚴格的表面滅菌處理，再經(jīng)無菌操作手續(xù)接到培養(yǎng)基上。 diyi步，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，如用適當?shù)乃⒆拥人⑾?。把材料切割成適當大小，即滅菌容器能放人為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時，沖洗時間視材料清潔程度而宜。易漂浮或細小的材料，可裝入紗布袋內(nèi)沖洗。流水沖洗在污染嚴重時特別有用。洗時可加入洗衣粉清洗，然后再用自來水沖凈洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質(zhì)性的物質(zhì)，便于滅菌液的直接接觸。當然，Z理想的清洗物質(zhì)是表面活性物質(zhì)—吐溫。 第二步是對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈臺或接種箱內(nèi)完成，準備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70%酒精浸10～30s。由于酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70%酒精穿透力強，也很易殺傷植物細胞，所以浸潤時間不能過長。有一些特殊的材料，如果實、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，以及主要取用內(nèi)部的材料，則可只用70%酒精處理稍長的時間。處理完的材料在無菌條件下，待酒精蒸發(fā)后再剝除外層，取用內(nèi)部材料。 第三步是用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據(jù)情況選取1—2種使用見表。第四步是用無菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，視采用的消毒液種類，涮洗3-l0次左右。無菌水涮洗作用是免除消毒劑殺傷植物細胞的副作用注意：①酒精滲透性強，幼嫩材料易在酒精中失綠，所以浸泡時間要短，防止酒精殺死植物細胞。②老熟材料，特別是種子等可以在酒精中浸泡時間長一些，如種子可以浸泡5分鐘。③的滲透力弱，一般浸泡10分鐘左右，對植物材料的殺傷力不大。④漂容易導致植物材料失綠，所以對于幼嫩材料要慎用。⑤在消毒液中加入濃度為0.08—0.12%的吐溫20或80（一種濕潤劑），可以降低植物材料表面的張力，達到更好的消毒效果。滅菌劑 使用濃度(%) 持續(xù)時間（min） 去除的難易 效果 次氯酸鈣 9~10 5~30 易 很好 次氯酸鈉 2 5~30 易 很好 0.1~1 5~8 較難 Z好 KJ素 4~50mg/L 30~60 中 較好 制備外植體 將已消毒的材料，用無菌刀、剪、鑷等，在無菌的環(huán)境下，剝?nèi)パ康镊[片、嫩枝的外皮和種皮胚乳等，葉片則不需剝皮。在操作中嚴禁用手觸動材料。 接種和培養(yǎng) （一）接種 在無菌壞境下，將切好的外植體立即接在培養(yǎng)基上，每瓶接種1－2個，以防止交叉污染。（二）封口 接種后，瓶、管用無菌藥棉或蓋封口，培養(yǎng)皿用無菌膠帶封口。 （三）溫度 培養(yǎng)基大多應保持在25℃左右，但要因花卉種類及材料部位的不同而區(qū)別對待。 增殖 外植體的增殖是組培的關鍵階段，在新梢等形成后為了擴大繁殖系數(shù)，需要繼代培養(yǎng)。把材料分株或切段轉入增殖培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)基一般在分化培養(yǎng)基上加以改良，以利于增殖率的提高。增殖1個月左右后，可視情況進行再增殖。 根的誘導 繼代培養(yǎng)形成的不定芽和側芽等一般沒有根，必須轉到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。1個月后即可獲得鍵壯根系。 組培苗的煉苗移栽 試管苗從無菌到光、溫、濕穩(wěn)定的環(huán)境進入自然環(huán)境，必須進行煉苗。一般移植前，先將培養(yǎng)容器打開，于室內(nèi)自然光照下放3天，然后取出小苗，用自來水把根系上的營養(yǎng)基沖洗干凈，再栽入已準備好的基質(zhì)中，基質(zhì)使用前Z好消毒。移栽前要適當遮蔭，加強水分管理，保持較高的空氣濕度（相對濕度98％左右），但基質(zhì)不宜過濕，以防爛苗。 植物組織培養(yǎng)方法 1 MS培養(yǎng)基的配制包括以下步驟. 培養(yǎng)基母液的配制和保存 MS培養(yǎng)基含有近30種營養(yǎng)成分，為了避免每次配制培養(yǎng)基都要對這幾十種成分進行稱量，可將培養(yǎng)基中的各種成分，按原量的20倍或200倍分別稱量，配成濃縮液，這種濃縮液叫做培養(yǎng)基母液.這樣每次使用時，取其總量的1/20（50 mL）或1/200（5 mL），加水稀釋，制成培養(yǎng)液.現(xiàn)將制備培養(yǎng)基母液所需的各類物質(zhì)的量列出，供配制時使用. 大量元素(母液Ⅰ) mg／L NH4NO3 33 000 KNO3 38 000 CaCl2·2H2O 8 800 MgSO4·7H2O 7 400 KH2PO4 3 400 微量元素(母液Ⅱ) KI 166 H3BO3 1 240 MnSO4·4H2O 4 460 ZnSO4·7H2O 1 720 Na2MoO4·2H2O 50 CuSO4·5H2O 5 CoCl2·6H2O 5 鐵鹽(母液Ⅲ) FeSO4·7H2O 5 560 Na2-EDTA·2H2O 7 460 有機成分(母液Ⅳ) ⅣA 肌醇 20 000 ⅣB 煙酸 100 鹽酸吡哆醇(維生素B6) 100 鹽酸硫胺素(維生素B1) 100 甘氨酸 400 以上各種營養(yǎng)成分的用量，除了母液Ⅰ為20倍濃縮液外，其余的均為200倍濃縮液. 上述幾種母液都要單獨配成1 L的貯備液.其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每種母液中的幾種成分稱量完畢后，分別用少量的蒸餾水徹底溶解，然后再將它們混溶，Z后定容到1 L. 母液Ⅲ的配制方法是：將稱好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分別放到450 mL蒸餾水中，邊加熱邊不斷攪拌使它們?nèi)芙猓缓髮煞N溶液混合，并將pH調(diào)至5.5，Z后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中. 各種母液配完后，分別用玻璃瓶貯存，并且貼上標簽，注明母液號、配制倍數(shù)、日期等，保存在冰箱的冷藏室中. MS培養(yǎng)基中還需要加入2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、6-芐基嘌呤（6BA）等植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，并且分別配成母液（0.1 mg/mL）.其配制方法是：分別稱取這3種物質(zhì)各10 mg，將2，4-D和NAA用少量（1 mL）無水乙醇預溶，將6BA用少量（1 mL）的物質(zhì)的量濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶解過程需要水浴加熱，Z后分別定容至100 mL，即得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的母液. 配制培養(yǎng)液 用量筒或移液管從各種母液中分別取出所需的用量：母液Ⅰ為50 mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5 mL.再取2，4-D 5 mL、NAA 1 mL，與各種母液一起放入燒杯中. 配制培養(yǎng)液時應注意：①在使用提前配制的母液時，應在量取各種母液之前，輕輕搖動盛放母液的瓶子，如果發(fā)現(xiàn)瓶中有沉淀、懸浮物或被微生物污染，應立即淘汰這種母液，重新進行配制；②用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤洗2次；③量取母液時，Z好將各種母液按將要量取的順序寫在紙上，量取1種，劃掉1種，以免出錯. 溶化瓊脂 用粗天平分別稱取瓊脂9 g、蒸糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸餾水750 mL，用電爐加熱，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀.然后再將配好的混合培養(yǎng)液加入到煮沸的瓊脂中，Z后加蒸餾水定容至1 000 mL，攪拌均勻. 調(diào)pH 用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時用精密的pH試紙（5.7.0）測培養(yǎng)基的pH，一直到培養(yǎng)基的pH為5.8為止（培養(yǎng)基的pH必須嚴格控制在5.8）. 2 BA為細胞分裂素 NAA 是萘乙酸，為生長素的一種 3 適于百合根的激素暫時沒找到 以下是葉片和胚的激素：對麝香百合 (LiliumlongiflorumThunb)葉片進行離體培養(yǎng) ，可成功獲得無菌苗.試驗結果表明 :培養(yǎng)基MS +BA 0 1mg/L +NAA 1 0mg/L適于初代培養(yǎng) ，有助于根和芽的分化 ;MS +BA 0 5mg/L +NAA1 5mg/L適于增殖培養(yǎng) ，利于愈傷組織的產(chǎn)生 ，并促進芽的分化 ;生根培養(yǎng)基為 1/ 2MS +NAA 1 0mg/L +多效唑 10 0mg/L ;當試管苗根長 1cm時移栽易成活 在含有1 mg/ L IAA，1 m g/ L GA3，6 0 0 m g/ L CH的 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng) ，蔗糖含量為 6 8%時 ，百合幼胚胚性生長Z好 ，培養(yǎng) 30 d后可以得到正常胚 .在含有 0 .1 m g/ L NAA，1 m g/ L BA的 MS培養(yǎng)基上可以形成淡綠色的愈傷組織 ，將這些愈傷組織轉移到 1 / 2 MS無激素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)可以形成大量的不定芽 ，不定芽生根移栽后 ，其成活率可達90 %以上

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