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  一粒粟9 2008-12-27 00:00:00

  一、氨基酸自動分析儀法 1.原理 食物蛋白質(zhì)經(jīng)鹽酸水解成為游離氨基酸，經(jīng)氨基酸分析儀的離子交換柱分離后，與茚三酮溶液產(chǎn)生顏色反應(yīng)，再通過分光光度計比色測定氨基酸含量。一份水解液可同時測定天冬，蘇，絲，谷，脯，甘，丙，纈，蛋，異亮，亮，酪，苯丙，組，賴和精氨酸等16種氨基酸，其Z低檢出限為10pmol。 2.適用范圍 GB/T14965-1994食物中氨基酸的測定方法。 本法適用于食物中的16種氨基酸的測定。其Z低檢出限為10pmol。本方法不適用于蛋白質(zhì)含量低的水果、蔬菜、飲料和淀粉類食物的測定 3.儀器和設(shè)備 3.1真空泵 3.2恒溫干燥箱 3.3水解管：耐壓螺蓋玻璃管或硬質(zhì)玻璃管，體積20～30ml。用去離子水沖洗干凈并烘干。 3.4真空干燥器（溫度可調(diào)節(jié)） 3.5氨基酸自動分析儀。 4.試劑 全部試劑除注明外均為分析純，實驗用水為去離子水。 4.1濃鹽酸：優(yōu)級純 4.26mol/L鹽酸：濃鹽酸與水1：1混合而成。 4.3苯酚：需重蒸餾。 4.4混合氨基酸標準液（儀器制造公司出售）：0.0025mol/L 4.5緩沖液： 4.5.1 pH2.2的檸檬酸鈉緩沖液：稱取19.6g檸檬酸鈉（Na3C6H5O7.2H2O）和16.5ml濃鹽酸加水稀釋到1000ml，用濃鹽酸或50%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至2.2 4.5.2 pH3.3的檸檬酸鈉緩沖液：稱取19.6g檸檬酸鈉和12ml濃鹽酸加水稀釋到1000ml，用濃鹽酸或50%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH至3.3。 4.5.3 pH4.0的檸檬酸鈉緩沖液：稱取19.6g檸檬酸鈉和9ml濃鹽酸加水稀釋到1000ml，用濃鹽酸或50%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4.0。 4.5.4 pH6.4的檸檬酸鈉緩沖液：稱取19.6g檸檬酸鈉和46.8g氯化鈉（優(yōu)級純）加水稀釋到1000ml，用濃鹽酸或50%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.4。 4.6茚三酮溶液 4.6.1 pH5.2的乙酸鋰溶液：稱取氫氧化鋰（LiOH.H2O）168g，加入冰乙酸（優(yōu)級純）279ml，加水稀釋到1000ml，用濃鹽酸或50%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至5.2。 4.6.2茚三酮溶液：取150ml二甲基亞砜（C2H6OS）和乙酸鋰溶液（2.6.1）50ml加入4g水合茚三酮（C9H4O3.H2O）和0.12g還原茚三酮（C18H10O6.2H2O）攪拌至完全溶解。 4.7高純氮氣：純度99.99%。 4.8 冷凍劑：市售食鹽與冰按1：3混合 5.操作步驟 5.1樣品處理：樣品采集后用勻漿機打成勻漿（或者將樣品盡量粉碎）于低溫冰箱中冷凍保存，分析用時將其解凍后使用。 5.2稱樣：準確稱取一定量樣品，精確到0.0001g。均勻性好的樣品如奶粉等，使樣品蛋白質(zhì)含量在10～20mg范圍內(nèi)；均勻性差的樣品如鮮肉等，為減少誤差可適當增大稱樣量，測定前再稀釋。將稱好的樣品防于水解管中。 5.3水解：在水解管內(nèi)加6mol/L鹽酸10～15ml（視樣品蛋白質(zhì)含量而定），含水量高的樣品（如牛奶）可加入等體積的濃鹽酸，加入新蒸餾的苯酚3～4滴，再將水解管放入冷凍劑中，冷凍3～5min，再接到真空泵的抽氣管上，抽真空（接近0psi），然后充入高純氮氣；再抽真空充氮氣，重復(fù)三次后，在充氮氣狀態(tài)下封口或擰緊螺絲蓋將已封口的水解管放在110±1℃的恒溫干燥箱內(nèi)，水解22h后，取出冷卻。 打開水解管，將水解液過濾后，用去離子水多次沖洗水解管，將水解液全部轉(zhuǎn)移到50ml容量瓶內(nèi)，用去離子水定容。吸取濾液1ml于5ml容量瓶內(nèi)，用真空干燥器在40～50℃干燥，殘留物用1～2ml水溶解，再干燥，反復(fù)進行兩次，Z后蒸干，用1mlpH2.2的緩沖液溶解，供儀器測定用。 5.4測定：準確吸取0.200ml混合氨基酸標準，用pH2.2的緩沖液稀釋到5ml，此標準稀釋濃度為5.00nmol/50μL，作為上機測定用的氨基酸標準，用氨基酸自動分析儀以外標法測定樣品測定液的氨基酸含量。 6.計算 上機樣品液（50mL）中氨基酸量（nmol）= 上機標準液（50mL）中氨基酸量（nmol）×樣品峰面積 氨基酸標準峰面積 所以，100g樣品中氨基酸的mg 數(shù)= 上機樣品液中氨基酸量（nmol）×f ×Mr×100 m×V×106 式中 f--樣品的稀釋倍數(shù) Mr--氨基酸的相對分子量 m--樣品質(zhì)量（g） V--上機時的進樣量（此處為50mL） 7.其他 7.1測定條件（以Beckman-6300型氨基酸自動分析儀為例） 緩沖液流量：20mL/h； 茚三酮流量：10mL/h； 柱溫：50、60和70℃； 色譜柱：20cm； 分析時間：42min。 7.2標準出峰順序和保留時間 序號 出峰順序 保留時間/min 序號 出峰順序 保留時間/min 1 天冬氨酸 5.55 9 蛋氨酸 19.63 2 蘇氨酸 6.60 10 異亮氨酸 21.24 3 絲氨酸 7.09 11 亮氨酸 22.06 4 谷氨酸 8.72 12 酪氨酸 24.52 5 脯氨酸 9.63 13 苯丙氨酸 25.76 6 甘氨酸 12.24 14 組氨酸 30.41 7 丙氨酸 13.10 15 賴氨酸 32.57 8 纈氨茇 16.65 16 精氨酸 40.75 7.3允許差： 同實驗室平行測定或連續(xù)兩次測定結(jié)果相對偏差值≤12%。

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