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  hdbdmxJicnsnZn 2008-05-10 00:00:00

  實(shí)驗(yàn)二十六 植物體內(nèi)多酚氧化酶活性的測定 一、目的 通過實(shí)驗(yàn)，掌握植物體內(nèi)多酚氧化酶活性的測定方法。 二、原理 多酚氧化酶是一種含銅的氧化酶，在有氧的條件下，能使一元酚和二元酚氧化產(chǎn)生醌。用分光光度法在525nm波長下測其吸光度，即可計(jì)算出多酚氧化酶的活力和比活性。反應(yīng)式如下： 多酚氧化酶 鄰苯二酚（兒茶酚）＋1∕2 O2 ——————→ 鄰醌 ＋ H2O 三、材料、儀器及試劑 1. 材料：馬鈴薯塊莖等 2. 儀器：UV－1206或UV－1240分光光度計(jì)；離心機(jī)；恒溫水??；研缽或勻漿機(jī)；試管；移液管；紗布袋等。 3. 試劑：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.01mol•L－1 pH 6.5磷酸緩沖液；0.1m mol•L－1pH6.5磷酸緩沖液；0.05 mol•L－1 pH5.5磷酸緩沖液；30%飽和度硫酸銨；0.1 mol•L－1兒茶酚； 20％三。 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 粗酶液的制備 稱取馬鈴薯塊莖5g于研缽中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸餾水浸洗，然后過濾以除去雜質(zhì)）和100ml 0.1mol•L－1pH6.5磷酸緩沖液，磨成勻漿，用幾層紗布袋過濾，濾液加入30%飽和度硫酸銨，離心除沉淀，上清液再加硫酸銨使達(dá)60％飽和度，離心收集沉淀。將所得沉淀溶于2～3ml 0.01mol•L－1 pH6.5磷酸緩沖液中，即為粗制酶液。 2. 活性酶的測定 在試管中加入3.9ml 0.05 mol•L－1 pH5.5磷酸緩沖液，1.0ml 0.1 mol•L－1兒茶酚在37℃恒溫水浴中保溫10min ，然后加入0.5ml酶液（可視酶活性增減用量），迅速搖勻，倒入比色杯內(nèi)，于525nm波長處以時(shí)間掃描方式，在1～2min內(nèi)測定吸光度變化（A）值。 五、酶活性的計(jì)算 以每min內(nèi)A525值變化0.01為1個(gè)酶活力單位，按下式計(jì)算多酚氧化酶的活力和比活性。 A 酶提取液總量（ml） 酶活力（0.01A•min－1）＝———————×——————————— 0.01×反應(yīng)時(shí)間 測定時(shí)酶液用量（ml） A 酶提取液總量（ml） 酶的比活性(0.01A•g－1Fw•min)＝—————————×—————————— 0.01×W×反應(yīng)時(shí)間 測定時(shí)酶液用量（ml） 公式中：A — 為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化值；W為樣品鮮重（g）。

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