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  獨(dú)倚夜空 2016-12-02 04:19:49

  1．菌種制備 ?。?0℃下保存的甘油管菌種（工作種子批），于室溫下融化。然后，接入搖瓶，培養(yǎng)溫度30℃，pH7.0，250 r/min活化培養(yǎng)18±2小時(shí)后，進(jìn)行吸光值測(cè)定和發(fā)酵液雜菌檢查。 2．種子罐培養(yǎng) 將已活化的菌種接入裝有30L培養(yǎng)基的種子罐中，接種量10%，培養(yǎng)溫度30℃，pH7.0，級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧為30%，培養(yǎng)3～4小時(shí)，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，同時(shí)取樣發(fā)酵液進(jìn)行顯微鏡檢查和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌。 3．發(fā)酵罐培養(yǎng) 將種子液通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量10%，培養(yǎng)溫度30℃，pH7.0。級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧30%，培養(yǎng)4小時(shí)。然后控制培養(yǎng)溫度20℃，pH6.0，溶解氧60%，繼續(xù)培養(yǎng)5～6.5小時(shí)。同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵液雜菌檢查，當(dāng)OD值達(dá)9.0±1.0后，用5℃冷卻水快速降溫至15℃以下，以減緩細(xì)胞衰老。或者將發(fā)酵液轉(zhuǎn)入收集罐中，加入冰塊使溫度迅速降至10℃以下。 4．菌體收集 將已降溫的發(fā)酵液轉(zhuǎn)入連續(xù)流離心機(jī)，16000 r/min離心收集。進(jìn)行干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性等項(xiàng)目的檢測(cè)。菌體于－20℃冰柜中保存時(shí)，不得超過(guò)12個(gè)月。每保存3個(gè)月，檢查一次活性。 11.4.3.4 干擾素發(fā)酵過(guò)程控制 在假單孢桿菌的發(fā)酵生產(chǎn)中，菌體在培養(yǎng)1.5小時(shí)分裂速度Z快，到3.5小時(shí)開(kāi)始下降。而干擾素的迅速合成出現(xiàn)在3.5小時(shí)之后，在4小時(shí)達(dá)到Z大，然后由于降解而迅速下降?？梢?jiàn)在發(fā)酵生產(chǎn)工藝中，假單孢桿菌的生長(zhǎng)和干擾素的生產(chǎn)基本處于不相關(guān)狀態(tài)，可采用兩段培養(yǎng)的策略進(jìn)行過(guò)程控制。 1．溶解氧控制 分別在生長(zhǎng)階段和生產(chǎn)階段采用各自Z佳溶解氧濃度，以期提高干擾素的發(fā)酵水平。通過(guò)級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速得以實(shí)現(xiàn)。 2．溫度控制 假單孢桿菌生長(zhǎng)Z適溫度與產(chǎn)物形成Z適溫度是不同的。產(chǎn)物合成溫度控制在20℃可以有效防止干擾素-α2b的降解，而其Z佳生長(zhǎng)溫度則為30℃。質(zhì)粒的穩(wěn)定性隨溫度的升高而迅速下降，因此在培養(yǎng)后期降溫可以減少目標(biāo)產(chǎn)物的降解，增加質(zhì)粒的穩(wěn)定性。 3．pH值 發(fā)酵過(guò)程中，pH的變化由工程菌的代謝、培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵條件所決定。干擾素-α的等電點(diǎn)在pH 6.0附近，在低酸性條件下穩(wěn)定，能耐受pH 2.5的酸性環(huán)境。因此可在發(fā)酵后期降低pH，從而造成大量蛋白酶失活，減少干擾素-α的水解，提高干擾素的積累量。

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