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  習(xí)慣成自然PAP 2014-03-23 00:00:00

  脅下心功1大心心情心兩個(gè)義務(wù)幣種兩

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  曉夢(mèng)兒壞壞 2014-03-23 00:00:00

  這題目考查的就是基因工程的步驟，詳細(xì)敘述下基因工程的步驟即可。提取目的基因：主要有兩條途徑：如果目的基因序列已知，則用限制性內(nèi)切酶從供體細(xì)胞的DNA中直接分離基因；如果序列未知，則人工合成基因。直接分離基因Z常用的方法是“鳥槍法”，用限制酶將供體細(xì)胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運(yùn)載體，然后通過運(yùn)載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細(xì)胞，讓供體細(xì)胞提供的DNA（即外源DNA）的所有片段分別在各個(gè)受體細(xì)胞中大量復(fù)制（在遺傳學(xué)中叫做擴(kuò)增），從中找出含有目的基因的細(xì)胞，再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來；人工合成基因的方法主要有兩條：一條途徑是以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模版，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需要的基因。另一條途徑是根據(jù)已知的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，推測(cè)出它的基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單鏈核苷酸為原料合成目的基因。目的基因與運(yùn)載體結(jié)合：這是基因工程的核心，三種Z常用的載體是細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒。如果以質(zhì)粒作為運(yùn)載體，首先要用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使質(zhì)粒出現(xiàn)一個(gè)缺口，露出黏性末端。然后用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。將切下的目的基因的片段插入質(zhì)粒的切口處，首先堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，兩個(gè)黏性末端吻合在一起，堿基之間形成氫鍵，再加入適量DNA連接酶，催化兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵，從而將相鄰的脫氧核糖核酸連接起來，形成一個(gè)重組DNA分子。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：基因工程中常用的受體細(xì)胞有大腸桿菌，枯草桿菌，土壤農(nóng)桿菌，酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。題目為原核系統(tǒng)，如受體細(xì)胞是細(xì)菌，一般是將細(xì)菌用氯化鈣處理，以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞。目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，就可以隨著受體細(xì)胞的繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌的繁殖速度非?？?，在很短的時(shí)間內(nèi)就能夠獲得大量的目的基因。目的基因的檢測(cè)和表達(dá)：目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，只有通過檢測(cè)與鑒定才能知道。檢測(cè)的方法有很多種，例如，大腸桿菌的某種質(zhì)粒具有青霉素抗性基因，當(dāng)這種質(zhì)粒與外源DNA組合在一起形成重組質(zhì)粒，并被轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞后，就可以根據(jù)受體細(xì)胞是否具有青霉素抗性來判斷受體細(xì)胞是否獲得了目的基因。重組DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞后，受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達(dá)過程。

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  lqqqianqi 2017-12-16 00:00:00

  你的題目關(guān)鍵是解決兩個(gè)問題：一是功能性基因在原核生物中的表達(dá)；二是如何GX進(jìn)行表達(dá)。 幫你在網(wǎng)上找到一入篇相關(guān)的文章。節(jié)選相關(guān)性較大的內(nèi)容如下，有需要的話，你追問我給你鏈接，因?yàn)榘俣葧?huì)吞掉帶有鏈接的回復(fù)。 ============================================================ 1、原核生物只有一種RNA 聚合酶（真核細(xì)胞有三種）識(shí)別原核細(xì)胞的啟動(dòng)子，催化所有 RNA的合成。 2、原核生物的表達(dá)是以操縱子為單位的。操縱子是數(shù)個(gè)相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因及其調(diào)控區(qū)的結(jié)合，是一個(gè)基因表達(dá)的協(xié)同單位。調(diào)控區(qū)主要分為三個(gè)部分：操縱基因、啟動(dòng)子及其他有調(diào)控功能的部位。 3、功能性基因一般是真核生物所具有的基因，而真核生物基因基本具有外顯子和內(nèi)含子等結(jié)構(gòu)。原核基因一般不含有內(nèi)含子，在原核細(xì)胞中缺乏真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，因此當(dāng)克隆的含有內(nèi)含子的真核基因在原核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄成 mRNA 前體后，其中內(nèi)含子部分不能被切除。 4、原核生物基因的控制主要在轉(zhuǎn)錄水平。這種控制要比對(duì)基因產(chǎn)物的直接控制要慢，對(duì)RNA 合成的控制有兩種方式：一是起始控制(啟動(dòng)子控制)，二是終止控制(衰減子控制)。 5、在大腸桿菌（大多工程菌都是使用大腸桿菌）mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)上，含有一個(gè)轉(zhuǎn)譯起始密碼子及同16S核糖體RNA 3'末端堿基互補(bǔ)的序列，即 SD 序列，而真核基因則缺乏此序列。因此，真核基因本身的mRNA前端部分不能直接使用，需要進(jìn)行一定的修飾。 將外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)，必須考慮表達(dá)載體、外源基因的性質(zhì)、原核細(xì)胞的啟動(dòng)子和 SD 序列、閱讀框架及宿主菌調(diào)控系統(tǒng)等基本條件，也就是說必須滿足以下條件： ⑴通過表達(dá)載體將外源基因?qū)胨拗骶?，并指?dǎo)宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白； ⑵外源基因不能帶有內(nèi)含子，因而必須用 cDNA 或全化學(xué)合成基因，而不能用基因組 DNA； ⑶必須利用原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動(dòng)子和 SD序列等調(diào)控元件控制外源基因的表達(dá)； ⑷外源基因與表達(dá)載體連接后，必須形成正確的開放閱讀框架(open reading frame)； ⑸利用宿主細(xì)胞的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)，防止外源基因的表達(dá)對(duì)宿主菌的毒害。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用Z廣泛的表達(dá)系統(tǒng)，由于待表達(dá)的外源基因結(jié)構(gòu)具有多樣性，尤其是真核生物基因的結(jié)構(gòu)與大腸桿菌基因結(jié)構(gòu)之間存在較大的差異，因而在構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)時(shí)必須具體情況具體分析。一般來說，GX表達(dá)外源基因必須考慮以下基本原則： ①優(yōu)化表達(dá)載體的設(shè)計(jì)。為了提高外源基因的表達(dá)效率，在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)對(duì)決定轉(zhuǎn)錄起始的啟動(dòng)子和決定 mRNA 翻譯的SD序列進(jìn)行優(yōu)化。具體方法包括組合強(qiáng)啟動(dòng)子和強(qiáng)終止子；增加 SD 序列中與核糖體 16S rRNA 互補(bǔ)配對(duì)的堿基因序列，使 SD 序列中6～8 個(gè)堿基與核糖體16S rRNA 的堿基完全配對(duì)；根據(jù)待表達(dá)外源基因的不同情況調(diào)整 SD 序列與起始密碼子 ATG 之間的距離及堿基的種類；防止核糖體結(jié)合位點(diǎn)附近序列轉(zhuǎn)錄后形成“莖環(huán)”二級(jí)結(jié)構(gòu)。 ②提高稀有密碼子 tRNA 的表達(dá)作用。多數(shù)密碼子具有簡(jiǎn)并性，而不同基因使用密碼子的頻率不相同。大腸桿菌基因?qū)δ承┟艽a子的使用表現(xiàn)了較大的偏愛性，在幾個(gè)同義密碼中往往只有一個(gè)或兩個(gè)被頻繁地使用。同義密碼子使用的頻率與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的 tRNA 的豐度呈正相關(guān)，稀有密碼子的tRNA在細(xì)胞內(nèi)的豐度很低。在 mRNA的翻譯過程中，往往會(huì)由于外源基因中含有過多的稀有密碼子而使細(xì)胞內(nèi)稀有密碼子的 tRNA供不應(yīng)求，Z終使翻譯過程終止或發(fā)生移碼突變。此時(shí)可通過點(diǎn)突變等方法將外源基因中的稀有密碼子轉(zhuǎn)換為在受體細(xì)胞中高頻出現(xiàn)的同義密碼子。 ③提高外源基因 mRNA 的穩(wěn)定性。大腸桿菌的核酸酶系統(tǒng)能專一性地識(shí)別外源 DNA或 RNA并對(duì)其進(jìn)行降解。對(duì)于 mRNA 來說，為了保持其在宿主細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，可采取兩種措施，一是盡可能減少核酸外切酶可能對(duì)外源基因 mRNA的降解，二是改變外源基因 mRNA 的結(jié)構(gòu)，使之不易被降解。 ④提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。大腸桿菌中含有多種蛋白水解酶，在外源基因表達(dá)產(chǎn)物的誘導(dǎo)下，蛋白水解酶的活性可能會(huì)增加。因此，須采用多種措施提高外源蛋白在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性。常用的方法包括：將外源基因的表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中；選用某些蛋白水解酶缺陷株作為受體菌；對(duì)外源蛋白中水解酶敏感的序列進(jìn)行修飾或改造；在表達(dá)外源蛋白的同時(shí)，表達(dá)外源蛋白的穩(wěn)定因子。 ⑤優(yōu)化發(fā)酵過程。在發(fā)酵罐內(nèi)工程菌生長到一定的階段后，開始誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)，誘導(dǎo)的方式包括添加特異性誘導(dǎo)物和改變培養(yǎng)溫度等。使外源基因在特異的時(shí)空進(jìn)行表達(dá)不僅有利于細(xì)胞的生長代謝，而且能提高表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)率。生物因素的第三方面是提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的總量。外源基因表達(dá)產(chǎn)物的總量取決于外源基因表達(dá)水平和菌體濃度。在保持單個(gè)細(xì)胞基因表達(dá)水平不變的前提下，提高菌體密度可望提高外源蛋白質(zhì)合成的總量。

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