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  HAN7168 2007-01-04 00:00:00

  ziyirenjiajia 你好！ 多肽合成技術(shù) 多肽藥物的研究與開發(fā)將作為二十一世紀(jì)高新技術(shù)竟?fàn)幍闹饕椖恐弧Ｉ锘钚远嚯脑趦?nèi)源性物質(zhì)中占有非常重要的地位，除酶、受體、金屬蛋白等生物大分子外，許多合成或分離的多肽對生理過程或病理過程，對疾病的發(fā)生、發(fā)展或ZL過程有重要意義。 氨基酸彼此以酰胺鍵（也稱肽鍵）相互連接的化合物稱作肽。一種肽含有的氨基酸少于10個就稱作寡肽，超過的就稱為多肽。多肽與蛋白質(zhì)只有肽鏈長短之別，二者間并沒有嚴(yán)格的區(qū)分。蛋白質(zhì)是生命存在的Z基本形式?？梢姸嚯氖巧?quot;橋"，蛋白質(zhì)工程從某種意義上而言就是研究多肽。 伴隨著分子生學(xué)物、生物化學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，多肽研究取得了驚人的、劃時代的飛躍。人們發(fā)現(xiàn)存在于生物體的多肽有數(shù)萬種，并且發(fā)現(xiàn)所有的細(xì)胞均能合成多肽。同時，幾乎所有的細(xì)胞也都受多肽調(diào)節(jié)，它涉及激素、神經(jīng)、細(xì)胞生長與生殖等各個領(lǐng)域，21世紀(jì)是一個多肽的世界，人們研究多肽，也渴望著將多肽應(yīng)用到Y(jié)L、保健、檢測等多個領(lǐng)域中去，為人類造福。 事實上，肽類藥物開發(fā)與應(yīng)用已走出科學(xué)家們的實驗室，變成了現(xiàn)實，并發(fā)揮著其獨(dú)特的功效。例如，神經(jīng)緊張肽（NT）能降低血壓，對腸和子宮具有收縮作用；內(nèi)啡肽和腦啡肽的衍生物有著很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用；促甲狀腺素釋放激素（TRH）是一種能促進(jìn)產(chǎn)婦乳汁分泌的多肽；能ZL糖尿病、胃潰瘍、炎的多肽是一種環(huán)狀的14肽；臨床上常用的催產(chǎn)素是一種多肽；已獲廣泛應(yīng)用的白蛋白多肽、胸腺肽、血清胸腺因子（FTS）等均可以引起免疫T細(xì)胞的分化；近日來在ZG及日本已開始使用的糖肽輔助ZL腫瘤，其作用機(jī)理是使淋巴系統(tǒng)活化等等。應(yīng)用多肽技術(shù)開發(fā)的醫(yī)用蛋白質(zhì)芯片（肽芯片）只有指甲蓋大小，放置了與腎炎、胃潰瘍和胃癌等相關(guān)的抗原分子，只要通過芯片閱讀儀便可檢測到有關(guān)疾病的功能狀態(tài)與變異情況。其功能已相當(dāng)于一個大型或中型實驗室、化驗室，效率是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)檢測的成百上千倍，受檢者幾乎沒有任何痛苦。肽芯片的廣泛應(yīng)用，已在醫(yī)學(xué)臨床檢測業(yè)引發(fā)一場技術(shù)革命。 自從1963年MERRIFIELD發(fā)展成功了固相多肽合成（SPPS）方法以來，經(jīng)過不斷的改進(jìn)和完善，到今天這個方法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個常用技術(shù)，表現(xiàn)出了經(jīng)典液相合成法無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。 固相合成的主要設(shè)計思想是：先將所要合成肽鏈的未端氨基酸的羧基以共價鍵的結(jié)構(gòu)同一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上。氨基酸作為氨基組分經(jīng)過脫去氨基保護(hù)基，并同過量的活化羥基組分反應(yīng)接長肽鏈。重復(fù)（縮合—洗滌—去保護(hù)—中和和洗滌—下一輪縮合）操作，達(dá)到所要合成的肽鏈長度；Z后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經(jīng)過純化等處理，即得所要的多肽。 http://www.pharmco.com.cn/technical-3.htm 多肽是涉及生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì)。它是分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物，由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結(jié)合而成。到現(xiàn)在，人們已發(fā)現(xiàn)和分離出一百多種存在于人體的肽，對于多肽的研究和利用，出現(xiàn)了一個的繁榮景象。 多肽的全合成不僅具有很重要的理論意義，而且具有重要的應(yīng)用價值。通過多肽全合成可以驗證一個新的多肽的結(jié)構(gòu)；設(shè)計新的多肽，用于研究結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；為多肽生物合成反應(yīng)機(jī)制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽藥物等。 多肽的化學(xué)合成技術(shù)無論是液相法還是固相法都已成熟。近幾十年來，固相法合成多肽更以其省時、省力、省料、便于計算機(jī)控制、便于普及推廣的突出優(yōu)勢而成為肽合成的常規(guī)方法并擴(kuò)展到核苷酸合成等其它有機(jī)物領(lǐng)域。本文概述了固相合成的基本原理、實驗過程，對其現(xiàn)狀進(jìn)行分析并展望了今后的發(fā)展趨勢。 1．固相合成的基本原理 多肽合成是一個重復(fù)添加氨基酸的過程，合成一般從C端（羧基端）向N端（氨基端）合成。過去的多肽合成是在溶液中進(jìn)行的，但自從1963年Merrifield發(fā)展成功了固相多肽合成方法以來，經(jīng)過不斷的改進(jìn)和完善，到今天固相法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個常用技術(shù)，表現(xiàn)出了經(jīng)典液相合成法無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。其基本原理是：先將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價鍵的結(jié)構(gòu)同一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經(jīng)過脫去氨基保護(hù)基并同過量的活化羧基組分反應(yīng)，接長肽鏈。重復(fù)（縮合→洗滌→去保護(hù)→中和和洗滌→下一輪縮合）操作，達(dá)到所要合成的肽鏈長度，Z后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經(jīng)過純化等處理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保護(hù)的稱為BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保護(hù)的稱為FMOC固相合成法， 2． 固相合成的具體試驗過程 2．1樹脂的選擇及氨基酸的固定 將固相合成與其他技術(shù)分開來的Z主要的特征是固相載體，能用于多肽合成的固相載體必須滿足如下要求：必須包含反應(yīng)位點(diǎn)（或反應(yīng)基團(tuán)），以使肽鏈連在這些位點(diǎn)上，并在以后除去；必須對合成過程中的物理和化學(xué)條件穩(wěn)定；載體必須允許在不斷增長的肽鏈和試劑之間快速的、不受阻礙的接觸；另外，載體必須允許提供足夠的連接點(diǎn)，以使每單位體積的載體給出有用產(chǎn)量的肽，并且必須盡量減少被載體束縛的肽鏈之間的相互作用。用于固相法合成多肽的高分子載體主要有三類：聚苯乙烯-苯二乙烯交聯(lián)樹脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇類樹脂及衍生物，這些樹脂只有導(dǎo)入反應(yīng)基團(tuán)，才能直接連上（diyi個）氨基酸。根據(jù)所導(dǎo)入反應(yīng)基團(tuán)的不同，又把這些樹脂及樹脂衍生物分為氯甲基樹脂、羧基樹脂、氨基樹脂或酰肼型樹脂。BOC合成法通常選擇氯甲基樹脂，如Merrifield樹脂；FMOC合成法通常選擇羧基樹脂如王氏樹脂。 氨基酸的固定主要是通過保護(hù)氨基酸的羧基同樹脂的反應(yīng)基團(tuán)之間形成的共價鍵來實現(xiàn)的，形成共價鍵的方法有多種：氯甲基樹脂，通常先制得保護(hù)氨基酸的四甲銨鹽或鈉鹽、鉀鹽、銫鹽，然后在適當(dāng)溫度下，直接同樹脂反應(yīng)或在合適的有機(jī)溶劑如二氧六環(huán)、DMF或DMSO中反應(yīng)；羧基樹脂，則通常加入適當(dāng)?shù)目s合劑如DCC或羧基二咪唑，使被保護(hù)氨基酸與樹脂形成共酯以完成氨基酸的固定；氨基樹脂或酰肼型樹脂，卻是加入適當(dāng)?shù)目s合劑如DCC后，通過保護(hù)氨基酸與樹脂之間形成的酰胺鍵來完成氨基酸的固定。 2．2氨基、羧基、側(cè)鏈的保護(hù)及脫除 要成功合成具有特定的氨基酸順序的多肽，需要對暫不參與形成酰胺鍵的氨基和羧基加以保護(hù)，同時對氨基酸側(cè)鏈上的活性基因也要保護(hù)，反應(yīng)完成后再將保護(hù)基因除去。同液相合成一樣，固相合成中多采用烷氧羰基類型作為α氨基的保護(hù)基，因為這樣不易發(fā)生消旋。Z早是用芐氧羰基，由于它需要較強(qiáng)的酸解條件才能脫除，所以后來改為叔丁氧羰基（BOC）保護(hù)，用TFA（三氟乙酸）脫保護(hù)，但不適用含有色氨酸等對酸不穩(wěn)定的肽類的合成。1978年，chang Meienlofer和Atherton等人采用Carpino報道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)作為α氨基保護(hù)基，F(xiàn)moc基對酸很穩(wěn)定，但能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脫去，近年來，F(xiàn)moc合成法得到了廣泛的應(yīng)用。 羧基通常用形成酯基的方法進(jìn)行保護(hù)。甲酯和乙酯是逐步合成中保護(hù)羧基的常用方法，可通過皂化除去或轉(zhuǎn)變?yōu)殡乱员阌糜谄瑪嘟M合；叔丁酯在酸性條件下除去；芐酯常用催化氫化除去。 對于合成含有半胱氨酸、組氨酸、精氨酸等帶側(cè)鏈功能基的氨基酸的肽來說，為了避免由于側(cè)鏈功能團(tuán)所帶來的副反應(yīng)，一般也需要用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基將側(cè)鏈基團(tuán)暫時保護(hù)起來。保護(hù)基的選擇既要保證側(cè)鏈基團(tuán)不參與形成酰胺的反應(yīng)，又要保證在肽合成過程中不受破壞，同時又要保證在Z后肽鏈裂解時能被除去。如用三苯甲基保護(hù)半胱氨酸的S-，用酸或銀鹽、汞鹽除去；組氨酸的咪唑環(huán)用2，2，2-三氟-1-芐氧羰基和2，2，2-三氟-1-叔丁氧羰基乙基保護(hù)，可通過催化氫化或冷的三氟乙酸脫去。精氨酸用金剛烷氧羰基（Adoc）保護(hù)，用冷的三氟乙酸脫去。 2．3成肽反應(yīng) 固相中的接肽反應(yīng)原理與液相中的基本一致，將兩個相應(yīng)的氨基被保護(hù)的及羧基被保護(hù)的氨基酸放在溶液內(nèi)并不形成肽鍵，要形成酰胺鍵，經(jīng)常用的手段是將羧基活化，變成混合酸酐、活潑酯、酰氯或用強(qiáng)的失去劑（如碳二亞氨）形成對稱酸酐等方法來形成酰胺鍵。其中選用DCC、HOBT或HOBT/DCC的對稱酸酐法、活化酯法接肽應(yīng)用Z廣。 2．4 裂解及合成肽鏈的純化 BOC法用TFA+HF裂解和脫側(cè)鏈保護(hù)基，F(xiàn)MOC法直接用TFA，有時根據(jù)條件不同，其它堿、光解、氟離子和氫解等脫保護(hù)方法也被采用。合成肽鏈進(jìn)一步的精制、分離與純化通常采用GX液相色譜、親和層析、毛細(xì)管電泳等。 3．固相合成的特點(diǎn)及存在的主要問題 固相合成法對于肽合成的顯著的優(yōu)點(diǎn)：簡化并加速了多步驟的合成；因反應(yīng)在一簡單反應(yīng)器皿中便可進(jìn)行，可避免因手工操作和物料重復(fù)轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的損失；固相載體共價相聯(lián)的肽鏈處于適宜的物理狀態(tài)，可通過快速的抽濾、洗滌未完成中間的純化，避免了液相肽合成中冗長的重結(jié)晶或分柱步驟，可避免中間體分離純化時大量的損失；使用過量反應(yīng)物，迫使個別反應(yīng)完全，以便Z終產(chǎn)物得到高產(chǎn)率；增加溶劑化，減少中間的產(chǎn)物聚焦；固相載體上肽鏈和輕度交聯(lián)的聚合鏈緊密相混，彼此產(chǎn)生一種相互的溶劑效應(yīng)，這對肽自聚集熱力學(xué)不利而對反應(yīng)適宜。 固相合成的主要存在問題是固相載體上中間體雜肽無法分離，這樣造成Z終產(chǎn)物的純度不如液相合成物，必需通過可靠的分離手段純化。 4．固相合成的研究發(fā)展前景 固相多肽合成已經(jīng)有40年的歷史了，然而到現(xiàn)在，人們還只能合成一些較短的肽鏈，更談不上隨心所欲地合成蛋白質(zhì)了，同時合成中的試劑毒性，昂貴費(fèi)用，副產(chǎn)物等一直都是令人頭痛的問題，而在生物體內(nèi)，核糖體上合成肽鏈的速度和產(chǎn)率都是驚人的，那么，是否能從生物體合成蛋白質(zhì)的原理上得到一些啟發(fā)，應(yīng)用在固相多肽合成（樹脂）上，這是一個令人感興趣的問題，也許是今后多肽合成的發(fā)展。 http://www.ptgcn.com/bbs/simple/index.php?t181.html

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