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  融雪白梅 2016-08-20 00:00:00

  基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF MS)是20世紀80年代發(fā)展起來的一種新型軟電離有機質(zhì)譜， 作為一種新興的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測技術(shù)， 現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域。同時作為一項新興的微生物鑒定技術(shù)， 受到了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。與傳統(tǒng)的生化表型鑒定方法和分子生物學(xué)方法相比， MALDI-TOF MS具有操作簡單、快速、準確和經(jīng)濟的特點。早在1975年， ANHALT等[1]利用質(zhì)譜儀結(jié)合高溫裂解技術(shù)第1次完成了細菌的鑒定， 從此拉開了質(zhì)譜鑒定細菌的“ 序幕” 。隨著質(zhì)譜檢測技術(shù)的不斷完善和發(fā)展， 近年來， MALDI-TOF MS已經(jīng)成功應(yīng)用于微生物的鑒定， 顯示了其在細菌、酵母菌等鑒定方面均具有良好的應(yīng)用價值。眾多的研究表明， MALDI-TOF MS技術(shù)對培養(yǎng)出的純菌落進行菌種鑒定具有很高的穩(wěn)定性及準確性， 對常見細菌和酵母菌的屬的鑒定率能達到97%~99%， 種的鑒定率也能達到85%~97%; 另外， MALDI-TOF MS大大縮短了細菌鑒定的時間， 而且其成本也較常規(guī)鑒定方法低[2， 3]。除此之外， MALDI-TOF MS已經(jīng)能夠成功地用于部分微生物亞種水平的鑒定和細菌耐藥性的檢測， 但這種方法在大多數(shù)情況下是應(yīng)用于培養(yǎng)出的純菌落的鑒定[3]。 如果能夠從臨床樣本中直接檢測細菌/真菌， 突破細菌/真菌培養(yǎng)陽性率低、培養(yǎng)時間長的瓶頸， 為細菌/真菌感染性疾病的診療提供更快、更準確的病原學(xué)依據(jù)， 將對臨床及時控制細菌/真菌感染性疾病起到更大的作用。國內(nèi)外學(xué)者已嘗試將質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于臨床樣本的直接檢測， 并取得了顯著的進展。本文就MALDI-TOF MS技術(shù)在臨床樣本的直接檢測應(yīng)用作一綜述。 一、MALDI-TOF MS檢測原理 MALDI-TOF MS技術(shù)用于微生物鑒定的實質(zhì)就是檢測具有屬、種或亞型特異性的生物標志的質(zhì)量信號， 主要是微生物菌體內(nèi)高豐度、表達穩(wěn)定和進化保守的核糖體蛋白。MALDI-TOF MS 儀器主要由基質(zhì)輔助激光解吸離子源(MALDI)和飛行時間質(zhì)量檢測器(TOF)兩部分組成。MALDI的原理是用一定強度的激光照射樣本與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜， 基質(zhì)從激光中吸收能量而汽化， 并迅速降解， 使樣本分解吸附， 基質(zhì)和樣本之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移從而使樣本分子發(fā)生電離; TOF的原理是帶有電荷的樣本分子在電場作用下加速飛過飛行管道， 因為離子的質(zhì)荷比與離子的飛行時間呈正比， 所以不同質(zhì)量的離子因達到檢測器的飛行時間不同而被檢測， 以離子峰為縱坐標、離子質(zhì)荷比為橫坐標形成特征性的質(zhì)量圖譜。將不同種屬微生物經(jīng)MALDI-TOF分析所形成的質(zhì)量圖譜與數(shù)據(jù)庫中的參考圖譜進行比較， 從而實現(xiàn)對目標微生物種或菌株的區(qū)分和鑒定[2]。 二、MALDI-TOF MS直接檢測臨床樣本的流程 臨床樣本直接檢測的流程主要包括3個部分:臨床樣本的預(yù)處理、樣本上機檢測和對比蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫得出鑒定結(jié)果。由于目前報道Z多的臨床樣本是陽性血培養(yǎng)瓶和中段尿樣本， 下面將以這二者為例介紹其直接檢測的流程， 其它臨床樣本的檢測流程與之類似。 (一)臨床樣本預(yù)處理 MALDI-TOF MS直接用于臨床樣本的檢測有2個基本的要求:(1)臨床樣本中細菌的量。為了得到準確的鑒定圖譜， MALDI-TOF MS技術(shù)對置于靶板上的細菌的Z低檢測限約為(1× 10^4)~(1× 10^6)cfu/mL。若要直接檢測擬似血流感染的血液樣本以及擬似泌尿系統(tǒng)感染的中段尿等臨床樣本中的病原菌， 首先必須富集細菌; (2)臨床樣本的質(zhì)。由于血液和血培養(yǎng)瓶中的大分子成分如血紅蛋白和其它蛋白成分、尿液中的白細胞等有機成分會干擾細菌的譜峰， 所以直接檢測前需要采取預(yù)處理措施去除這些干擾因素。 1.陽性血培養(yǎng)瓶直接檢測 直接檢測陽性血培養(yǎng)瓶的細菌濃度常常需要1× 10^7 cfu/mL[2， 4]。由于在血流感染患者血液中的細菌量常常很低(Z低可< 1~10 cfu/mL)， 因此對血樣本的直接檢測需要一個增菌的過程， 即采用血培養(yǎng)瓶增菌。目前已報道的陽性血培養(yǎng)病原菌預(yù)處理程序各不相同， 但預(yù)處理過程主要包含了以下2個步驟:(1)將細菌從血細胞中分離出來。先應(yīng)用溫和去污劑(如吐溫-80、十二磺基硫酸鈉、皂素等)將血液中的血細胞溶解， 然后通過不同的流程(離心、洗滌)去除其它的干擾因素， 純化要鑒定的細菌樣本; (2)將菌體中的蛋白質(zhì)抽提出來。Z常用的是混合溶劑處理法， 使用甲酸/乙腈溶液對樣本進行處理來抽提蛋白， 利用2種溶劑的混合作用將菌體表面的蛋白和存在于細胞

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