本文節(jié)選自《實驗卒中手術(shù)學(xué)》主編：楊國源

書號：ISBN 978-7-5046-6264-4/R·1648

氯化三苯基四氮唑（TTC）染色

       氯化三苯基四氮唑TTC（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride）染色是一種定量檢測腦梗塞體積的迅速、方便、便宜、可靠的方法，它是一種用于評價組織內(nèi)脫氫酶活性的標(biāo)準(zhǔn)染色方法。大腦切成2毫米的切片后，放入2%TTC溶液中，TTC能與正常線粒體氧化酶系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)而降解成深紅色，而梗塞部位受損以致線粒體缺乏降解TTC的酶的能力而不會被TTC染色，呈現(xiàn)白色，使得受損組織與正常組織極易區(qū)分開來。

       目前，很多學(xué)者釆用TTC染色標(biāo)記腦組織缺血性損傷，計算腦梗死灶體積。該方法能清楚地區(qū)分正常腦組織和梗死腦組織的界線，但要求實驗者在取材時要速度快，在極短時間內(nèi)將組織投入TTC溶液中。組織中斷血供時間過長，會造成新的損傷區(qū)域，致使測量出現(xiàn)較大誤差，甚至組織完全不能染色。剝離和切片時應(yīng)十分注意。因為腦組織十分脆軟，容易出現(xiàn)碎裂，給測量帶來不便（如下圖所示）。

MCAO術(shù)后TTC染色

白色為梗塞部位；深紅色為正常部位

一、實驗材料

       1.TTC溶液。

       2.磷酸鹽緩沖液。

       3.刀片。

       4.大腦模具。

       5.培養(yǎng)皿。

       6.載玻片。

       7.4%多聚甲醛。

二、TTC染色過程

       1.動物處死后，取腦并且小心地浸入低溫磷酸鹽緩沖液中。這樣使大腦更加堅硬，方便切片。

       2.用刀片把大腦切成2毫米厚片。

       3.切片時要小心，因為腦組織容易粘在刀片上。為了防止損傷，刀片先浸入2%TTC溶液中。TTC溶液對光和熱敏感，在不使用的時候要用鋁箔包好。切好的腦片放入TTC溶液中進行染色并且持續(xù)觀察顏色的改變?？梢约訜崾惯@個過程變快，比如放入37℃的培養(yǎng)箱。

       4.當(dāng)腦片表面開始變成粉紅色，翻轉(zhuǎn)腦片。染上色的是具有活性的腦組織。梗塞的部分由于線粒體失活，所以不能被染色，仍然為白色。

       5.當(dāng)腦片變成紅色，反應(yīng)結(jié)束，用磷酸鹽緩沖液洗去TTC溶液。

       6.腦片要進行拍照，來確定梗塞量。也可以把腦片放入多聚甲醛中過夜進行固定。這樣拍照更加方便。此步一定要注意避光，否則染色還會褪色。

三、應(yīng)用TTC檢測的注意點

       1.TTC染色是計算梗塞量的標(biāo)準(zhǔn)方法。

       2.TTC溶液對光敏感，因此要避光保存。

       3.染色前是否進行磷酸鹽緩沖液灌注不影響實驗的結(jié)果。

文末福利

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1.冰凍切片蘇木素伊紅染色

1、將4%多聚甲醛灌注后的大腦，用冰凍切片機切片，厚度為10~40微米。

2、將腦片貼在載玻片上，并且吹干過夜。

3、將腦片脫脂（若是腦組織直接冰凍，則不需要脫脂）：

       （a）將腦片浸沒在氯仿和乙醇混合物中至少1小時。

       （b）將腦片分別在、95%、70%和50%的乙醇中各浸泡5分鐘，然后用蒸餾水沖洗。

注意：必須等到片子完全干燥（沒有水滴）。如果腦片是幾天前準(zhǔn)備的，在染色之前必須放到蒸餾水中浸泡5分鐘。

4、染色步驟：

       （a）將蘇木素滴在腦片上，染色20~25分鐘。整個過程用眼睛或顯微鏡觀察，保證細胞核變藍。

       （b）用蒸餾水洗2次。

       （c）用0.25%的氨水溶液輕輕沖洗約10秒。

       （d）用蒸餾水洗2次。

       （e）用伊紅染色10秒

       （f）用蒸餾水洗2次。

       （g）用70%、80%、90%、95%、的乙醇脫水1次，每次3分鐘。

       （h）用乙醇與二甲苯混合液脫水3分鐘。

       （i）用二甲苯處理5分鐘

       （j）滴2~3滴封片劑，用蓋玻片封住腦片，準(zhǔn)備在顯微鏡下觀察。

2.石蠟切片的蘇木素-伊紅染色

1、修剪組織：如果大腦固定在4%6的多聚甲醛里，那么修剪組織必須在通風(fēng)櫥里進行。去除小腦和嗅球部分。大腦用水沖洗干凈，冠狀切片切成3份。組織放在生理鹽水中。

2、處理以及石蠟包埋：在自動包埋機上進行包埋。金屬盒放在機器中過夜。組織進行梯度脫水，并用石蠟進行包埋。

3、組織包埋的步驟:

       （a）加熱溫度控制在59~61℃；

       （b）樣品控制臺溫度在59~61℃；

       （c）冷凍臺溫度為5℃；

       （d）組織轉(zhuǎn)移到加熱臺上，浸在石蠟中，然后移至樣品控制臺。

注意：不要把樣品放反了，同時要保持它們的方向一致。把鐵塊放在冷凍臺上，冷卻20分鐘。

4、室溫下在切片機上切片：

       （a）水浴溫度控制在45~50℃。

       （b）石蠟組織放在冰水混合物中。

       （c）室溫下設(shè)置好切片機。

       （d）45℃，吹干載玻片20分鐘。

       （e）蠟塊固定在切片機上，修整蠟塊表面，直至大腦組織出現(xiàn)。

       （f）切片，厚度可根據(jù)試驗要求，切成4~10微米。

       （g）腦片轉(zhuǎn)移到水浴中，然后貼在載玻片上。

5、預(yù)染：載玻片在60℃的烘箱中烤片15分鐘，融化石蠟，使乙醇揮發(fā)。注意用架子架住載玻片。

6、HE染色：可以自動也可以手動進行。

1）自動：染色在染色機中進行，依次用以下溶液處理：

       （a）3次二甲苯；

       （b）2次乙醇；

       （c）2次95%乙醇；

       （d）蘇木素染色；

       （e）2次95%乙醇；

       （1）70%乙醇；

       （g）伊紅染色；

       （h）70%乙醇；

       （i）3次二甲苯。

2）手動：每一步驟約1~2分鐘，整個過程需要25~30分鐘。載玻片放入盒子中，滴2~3滴封片劑，然后用蓋玻片小心地蓋在上面。

① 注意事項：

       （a）封片前片子不要干燥，封片劑將地封住腦片；

       （b）在完全干燥之前保證片子平整；

       （c）在顯微鏡下觀察片子的染色效果。例如：如果組織在冰盒中的浸泡時間不足夠長，組織看起來會有皺褶。如果漂片溫度太高，片子會碎，如果溫度太低，片子不能漂浮。

② 手動的HE染色方法：

       （a）3次二甲苯，每次2分鐘，脫去脂肪和蠟；

       （b）乙醇，每片10滴；

       （c）95%乙醇，2次，每片10滴；

       （d）蒸餾水洗；

       （e）蘇木素染色15分鐘；

       （f）蒸餾水洗2次；

       （g）0.25%氨水洗，直至組織變藍；

       （h）蒸餾水洗2次；

       （i）0.5%的伊紅染色，每片10~20滴；

       （j）95%乙醇，洗2次，每片10~15滴；

       （k）乙醇，每片10滴；

       （l）3次二甲苯，每片10滴。

蘇木素伊紅染色后細胞核呈藍色，細胞質(zhì)呈粉紅色或紅色。如下圖所示：

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