高品質(zhì)的熒光顯微鏡是臨床實(shí)驗(yàn)室完成間接免疫熒光檢測(cè)的必備實(shí)驗(yàn)條件。目前，大部分臨床實(shí)驗(yàn)室的熒光顯微鏡還是采用傳統(tǒng)的汞燈作為光源。為了提高臨床檢驗(yàn)的工作效率、改善檢測(cè)環(huán)境，廣州明美推出了一整套的LED熒光顯微鏡和顯微成像系統(tǒng)解決方案。該解決方案包括LED熒光顯微鏡和顯微成像系統(tǒng)。

相對(duì)于傳統(tǒng)汞燈光源， LED光源具有的優(yōu)勢(shì)
1.特定的LED光源發(fā)射特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，能夠更有效的激發(fā)樣品；非紫外LED不存在紫外輻射，高度確保使用者的安全。
2.超長(zhǎng)的使用壽命（50,000小時(shí)），是傳統(tǒng)汞燈的250倍，極大地延長(zhǎng)了顯微鏡壽命、降低實(shí)驗(yàn)成本；且在壽命內(nèi)輸出強(qiáng)度、波長(zhǎng)穩(wěn)定，確保激發(fā)的有效性。
3.實(shí)時(shí)開關(guān)，不需要預(yù)熱、冷卻。獨(dú)特的LED系統(tǒng)，納米級(jí)的響應(yīng)時(shí)間，打開電源開關(guān)后可以立即達(dá)到全功率輸出，實(shí)時(shí)開關(guān)不會(huì)影響到光源。
4.LED安全性高、冷光源、體積小，可隨意搬動(dòng)，不存在汞泄露污染、發(fā)燙問題。
5.使用過程中，無需光路調(diào)節(jié)。
6.攜帶亮度調(diào)節(jié)旋鈕，避免過高亮度引起的熒光淬滅。
7.可選配便攜式移動(dòng)電源，隨意移動(dòng)，突然停電也不會(huì)影響使用。

MF-LED熒光附件

MF-LED熒光模塊的推出，為免疫熒光實(shí)驗(yàn)室熒光顯微鏡解決方案提供了一種可能。借助LED熒光模塊，可輕松地將一臺(tái)無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)的普通顯微鏡轉(zhuǎn)化為模塊化的、節(jié)能GX的、易于操作和超長(zhǎng)壽命的熒光顯微鏡，實(shí)現(xiàn)GX的熒光觀察。

間接免疫熒光檢測(cè)用MF-LED的主要參數(shù)如下：

MSHOT 顯微成像系統(tǒng)

間接免疫熒光檢測(cè)自身抗體時(shí)，可觀察到各種不同的熒光核型和表現(xiàn)，廣州明美為熒光檢測(cè)/觀察提供了專業(yè)的顯微數(shù)碼成像系統(tǒng)—MC系列/MD系列。借助這些高分辨率、高清晰度、高像素、高靈敏度的成像系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)捕獲各種清晰的熒光圖像，以做檢測(cè)結(jié)果記錄、典型案例討論、核型判讀教學(xué)等。

左圖：明美MF-B-LED搭配Olympus CX22顯微鏡主機(jī)（含物鏡）、明美三檔三目分光器件、明美數(shù)碼相機(jī)MC20-N組成的熒光解決方案；右圖：該熒光解決方案的拍攝效果圖。

（來源：廣州市明美光電技術(shù)有限公司）

倒置熒光顯微鏡下的免疫熒光細(xì)胞：探索微觀世界的奧秘

顯微鏡觀察免疫熒光細(xì)胞是一種重要的實(shí)驗(yàn)方法，用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等成分的表達(dá)、功能和相互作用，目前，免疫熒光顯微鏡已經(jīng)成為生物學(xué)研究中不可或缺的工具之一。

在倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞時(shí)，需要選擇合適的顯微鏡參數(shù)，以確保觀察的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。例如，光源的種類、顯微鏡的分辨率、物鏡放大倍數(shù)和熒光通過率等因素。此外，在進(jìn)行免疫熒光顯微鏡觀察細(xì)胞時(shí)，需要選擇合適的熒光強(qiáng)度和熒光顏色，以避免對(duì)觀察結(jié)果的干擾。

倒置熒光顯微鏡MF52-N采用無限遠(yuǎn)光學(xué)設(shè)計(jì)和數(shù)顯LED熒光模塊，光路經(jīng)過深度優(yōu)化，能提供簡(jiǎn)單易用的熒光激發(fā)和高質(zhì)量的相襯、熒光和明場(chǎng)成像，可選雙光路、一體供電、人走燈滅，廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)、生物制藥、醫(yī)療檢測(cè)等領(lǐng)域。

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來源：https://www.mshot.com/article/1810.html

明美倒置熒光顯微鏡應(yīng)用于免疫熒光觀察

免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。利用熒光顯微鏡可以看見熒光標(biāo)記的細(xì)胞器、細(xì)菌或病毒等目標(biāo),從而確定目標(biāo)的有無和分布，以及利用定量技術(shù)（比如流式細(xì)胞儀）測(cè)定含量。

此次，廣西區(qū)域客戶需要一套倒置熒光顯微鏡，主要看細(xì)胞、免疫熒光觀察，用于做靶向藥理，同時(shí)需要能在電腦成像，拍照保存與分析。明美廣西區(qū)域負(fù)責(zé)人推薦了倒置熒光顯微鏡MF52-N,搭配2000萬像素顯微鏡相機(jī)MDX10，呈現(xiàn)效果獲得客戶認(rèn)可。

倒置熒光顯微鏡MF52-N, 人體工學(xué)設(shè)計(jì)，觀察操作省心；可實(shí)現(xiàn)明場(chǎng)、熒光、相差觀察；載物臺(tái)可匹配主流規(guī)格培養(yǎng)容器，也可拆下移動(dòng)平臺(tái)節(jié)省空間，滿足用戶切片或培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿等多種樣品觀察

倒置熒光顯微鏡MF52-N既可應(yīng)用于細(xì)胞組織，透明液態(tài)組織的顯微觀察，也可用于生物制藥、醫(yī)學(xué)檢測(cè)、疾病預(yù)防等領(lǐng)域內(nèi)的熒光顯微觀察。

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來源：明美倒置熒光顯微鏡應(yīng)用于免疫熒光觀察 (mshot.com)

　　1. 基本信息

　　下面的應(yīng)用描述了小鼠巨噬細(xì)胞系RAW-264.7（生物安全等級(jí)2）在ibidi μ-Slides VI 0.4 和8孔腔室載玻片的培養(yǎng)方案。這是一個(gè)特殊的細(xì)胞系的例子，用于顯示粘附時(shí)間，細(xì)胞密度和細(xì)胞形態(tài)的示范。本應(yīng)用可根據(jù)您的具體實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行調(diào)整。

　　2. 材料

　　在設(shè)置中應(yīng)用下列材料：

　　·RAW-264.7 (murine macrophages, CLS - Cell Lines Service, Biosafety Level 2) 

　　·Medium: RPMI 1640 with 2 mM L-Glutamin and 10% FBS 

　　·μ-Slide VI 0.4, ibiTreat （ibidi 80606）

　　·μ-Slide 8 well, ibiTreat （ibidi 80826）

　　·Accutase (PAA Laboratories GmbH) 

　　·1x Phosphate buffered saline (PBS) 

　　3. 細(xì)胞培養(yǎng)與材料制備

　　在將細(xì)胞接種到玻片中之前，按照常規(guī)的方法培養(yǎng)細(xì)胞。

　　μ-Slide VI 0.4 ：通道玻片和培養(yǎng)基，在37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。這對(duì)于避免隨著時(shí)間的推移出現(xiàn)氣泡至關(guān)重要。為此，在50 ml器中填充適量的培養(yǎng)基，并輕輕地將瓶蓋擰緊。在 μ-Slide 8孔載玻片開放孔井中，氣泡可排出到大氣中。

　　拆開μ-Slide的包裝，把它放在μ-Slide支架上，并在準(zhǔn)備細(xì)胞懸浮液時(shí)同時(shí)將蓋子放在 Luer 適配器/孔上。

　　4. 播種細(xì)胞

　　分離細(xì)胞：

　　吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，并用PBS洗滌細(xì)胞一次。每75cm2 燒瓶中加入3-5 ml的Accutase，并將燒瓶放入培養(yǎng)箱中以加快分離速度。如果是RAW-264.7細(xì)胞系，則大約需要8分鐘。使用Accutase分離的細(xì)胞存活率更高。

　　4.1. 將細(xì)胞接種到μ-Slide VI 0.4中

　　在μ-Slide VI 0.4建議的細(xì)胞濃度：最終細(xì)胞數(shù)  0.3 x 10 5 cells/cm2，制備濃度6 x 10 5cells/ml。通過將移液器尖端直接放在通道的入口上，將30 μl細(xì)胞懸浮液填充到每個(gè)通道中。將蓋子蓋在玻片上，在37°C和5％CO2下孵育半小時(shí)以固定細(xì)胞。

　　細(xì)胞貼壁后，分別用60 μl無細(xì)胞培養(yǎng)基填充儲(chǔ)液池。 避免將移液器吸頭直接指向通道的入口。將玻片放回培養(yǎng)箱中。

　　圖1：接種后一小時(shí)，在ibiTreat μ-Slide VI 0.4（貨號(hào)80606）中的RAW-264.7

　　圖2: 在ibiTreat μ-Slide VI 0.4中的RAW-264.7，孵育24小時(shí)后

　　圖3:在ibiTreat μ-Slide VI0.4中的RAW-264.7，培養(yǎng)四天后

　　4.2 將細(xì)胞播種在μ-Slide 8 well 中

　　在μ-Slide 8 well建議的細(xì)胞濃度：最終細(xì)胞數(shù) 0.3 x 10 5 cells/cm2 ，制備濃度 1.1 x 10 5 cells/ml。將300 μl 的細(xì)胞懸浮液注入各孔中。將蓋子蓋在玻片上，在37°C和5% CO2中孵育。不需要進(jìn)一步添加培養(yǎng)基。

　　圖4：在ibiTreat μ-Slide 8 well(貨號(hào)：80826)中的RAW-264.7，播種后1小時(shí)

　　圖5: 在ibiTreat μ-Slide 8 well中的RAW-264.7，孵育24小時(shí)后

　　圖6：在ibiTreat μ-Slide 8 well中的RAW-264.7，經(jīng)過四天的培養(yǎng)

　　為獲得最佳的分布的勻的細(xì)胞，我們建議使用像μ-Slide VI 0.4 這樣的通道載玻片。在8孔腔室載玻片中，細(xì)胞密度可能會(huì)在孔的整個(gè)表面上因點(diǎn)而異，具體取決于細(xì)胞播種過程中的處理。

　　5. 免疫熒光染色

　　像往常一樣為您的細(xì)胞固定和染色。

　　注意：在 μ-Slides 中染色時(shí)注意液體的處理

　　μ-Slide VI 0.4 ：更換液體，先吸出兩個(gè)儲(chǔ)液池而不排空通道。 如果您使用的是真空設(shè)備，請(qǐng)注意不要將吸頭直接放在通道的入口上。 用100 μl新溶液沖洗通道3次。 從一側(cè)添加新的溶液，通過通道流入另一個(gè)儲(chǔ)液池，然后從另一側(cè)吸出，直到兩個(gè)儲(chǔ)液池都排空。注意通道永遠(yuǎn)不要干涸！

　　μ-Slide 8孔載玻片：在 μ-Slide 8孔中，無需特殊處理措施。像在任何其他培養(yǎng)皿或孔板中一樣的交換液體。

　　下文中，給出了使用以下材料對(duì)細(xì)胞核和肌動(dòng)蛋白絲進(jìn)行染色的示例：

　　細(xì)胞核：DAPI（Diamidino pheylindol dihydrochlorid） SIGMA, 32670 

　　肌動(dòng)蛋白絲：Phalloidin, Alexa Fluor ? 488 Conjugate, LONZA, PA-3010 

　　1. 用3.7% 的PFA在PBS（pH 7.4）中室溫下固定細(xì)胞10分鐘。

　　2. 用PBS清洗細(xì)胞三次。

　　3. 用Triton X 100（0.1%）孵育細(xì)胞5分鐘。

　　4. 用PBS清洗細(xì)胞三次。

　　5. 用1%牛血清白蛋白在PBS中孵育20分鐘。

　　6. 用PBS清洗細(xì)胞三次。

　　7. 在0.2μm濃度下用鬼筆環(huán)肽Alexa For 488孵育細(xì)胞20分鐘。

　　8. 用PBS清洗細(xì)胞三次。

　　9. 用DAPI（0.5μg/ml）孵育細(xì)胞10分鐘。

　　10. 用PBS清洗細(xì)胞三次。

　　11. 完全吸出通道并用ibidi封片劑重新填充。 現(xiàn)在樣品可在顯微鏡上觀察了。保存在陰暗陰涼處可儲(chǔ)存數(shù)周。

　　圖7：在 μ-Slide VI 0.4中的RAW-264.7用DAPI（細(xì)胞核、藍(lán)色）和Phalloidin, Alexa Fluor ? 488 Conjugate（肌動(dòng)蛋白絲，綠色）

　　免疫熒光實(shí)驗(yàn)原理

　　免疫熒光(IF)是使用顯微鏡深入了解細(xì)胞結(jié)構(gòu)和過程的有效方法。此方法可評(píng)估特定蛋白質(zhì)的表達(dá)和位置，使得免疫熒光成為科學(xué)家解決許多細(xì)胞生物學(xué)問題不可或缺的工具。

　　免疫熒光實(shí)驗(yàn)基于以下主要步驟：

　　1.特異性抗體與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合。

　　2.熒光染料與這些免疫復(fù)合物偶聯(lián)，以便使用顯微鏡觀察感興趣的蛋白質(zhì)。

　　內(nèi)皮細(xì)胞中vWF的免疫熒光染色。肌動(dòng)蛋白用phalloidin染色(綠色)，細(xì)胞核用DAPI染色(藍(lán)色)。

　　區(qū)分直接和間接免疫熒光。在直接免疫熒光中，一抗直接偶聯(lián)到熒光團(tuán)（也稱為熒光色素），便于處理和快速可視化。在間接免疫熒光中，使用特異性結(jié)合一抗的二級(jí)熒光團(tuán)偶聯(lián)抗體來可視化感興趣的結(jié)。

　　盡管di二種方法比直接免疫熒光更耗時(shí)，但它有幾個(gè)顯著的優(yōu)勢(shì)，比如它通常更便宜，因?yàn)槎箍梢杂糜诓煌囊豢埂４送?，通過結(jié)合多個(gè)一抗和特定的二抗(每個(gè)抗體都用不同的熒光團(tuán)標(biāo)記)，可以在單個(gè)樣品中平行特異地顯示多個(gè)蛋白質(zhì)(多色免疫熒光)。

　　免疫熒光染色:典型的工作流程

　　每個(gè)免疫熒光染色方案由培養(yǎng)、固定、染色、成像四個(gè)主要步驟組成，可細(xì)分如下:

　　免疫熒光染色是一種非常敏感的方法，可能需要排除故障《免疫英冠染色故障排除指南》。方案中的微小變化可能會(huì)導(dǎo)致不同的結(jié)果，而這些結(jié)果不再具有可比性。因此，在您的特定方案中精確地保持完全相同的條件是非常重要的(例如，細(xì)胞密度、抗體稀釋度、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間)。

　　免疫熒光實(shí)驗(yàn)方案對(duì)比

　　傳統(tǒng)染色與ibidi方案染色

　　當(dāng)使用任何ibidi解決方案時(shí)，ibidi的免疫熒光染色方案比傳統(tǒng)方案要簡(jiǎn)便快速的多。無需在松散的蓋玻片上生長(zhǎng)細(xì)胞，細(xì)胞可直接在ibidi玻片上生長(zhǎng)和染色。

　　用于免疫熒光應(yīng)用的各種ibidi產(chǎn)品

　　更多ibidi相關(guān)產(chǎn)品的免疫熒光實(shí)驗(yàn)應(yīng)用可查閱我們雷萌公眾號(hào)相關(guān)文章！

　　參考文獻(xiàn)

　　K.G. Zyner, A. Simeone, S.M. Flynn, et al. G-quadruplex DNA structures in human stem cells and differentiation. Nat Commun, 2022, 10.1038/s41467-021-27719-1

　　C. Xu, et al. NPTX2 promotes colorectal cancer growth and liver metastasis by the activation of the canonical Wnt/beta-catenin pathway via FZD6. Cell Death & Disease, 2019, 10.1038/s41419-019-1467-7

　　Kobayashi, T., et al. Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems. Nature, 2017, 10.1038/nature22812

　　H. Tada et al. Porphyromonas gingivalis Gingipain-Dependently Enhances IL-33 Production in Human Gingival Epithelial Cells. PloS one, 2016, 10.1371/journal.pone.0152794

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