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  回眸一群豿 2008-08-07 00:00:00

  一般情況下一管溶液在其溶質(zhì)的溶解過程中或完全溶解之后，其在溶劑中的密度分布是不同的，在溶液尚未達(dá)到完全混合的均勻狀態(tài)之前，單位尺度上存在的密度的差值，即為密度梯度。可以表示為：（密度2-密度1）/（密度2的位置坐標(biāo)-密度1的位置坐標(biāo)） 連續(xù)梯度 1、 測(cè)量DNA溶液的體積，按lg/ml的用量精確地加入固體CsCl， 將溶液加溫至30℃助溶。溫和地混勻溶液直到鹽溶解。 2、 每10mlDNA溶液加入0.8ml溴化乙錠溶液（10mg/ml溶于水）；立即將溴化乙錠溶液（漂浮在表層）與DNA－氯化銫溶液混勻， 溶液的終密度應(yīng)為1.55g/ml（溶液的折射率為1.3860）溴化乙錠濃度大約740μg/ml?！句寤义V貯存液應(yīng)貯存于避光容器內(nèi)（如用錫箔完全包裹的瓶子），于室溫保存。 3、 室溫下用Sorvall SS34頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）以8000rpm離心5min， 浮在溶液上面的水垢狀浮渣是溴化乙錠和細(xì)菌蛋白所形成的復(fù)合物。 4、 用巴斯德吸管或帶大號(hào)針頭的一次性注射器將浮渣下的清亮紅色溶液轉(zhuǎn)移到離心管中。用輕石蠟油加滿管的其余部分并封口。 5、 以20℃對(duì)所得的密度梯度以45 000rpm離心16h（VTi65 轉(zhuǎn)頭）、 以45 000rpm離心48h（Ti50轉(zhuǎn)頭）、以60 000rpm離心24h（Ti65轉(zhuǎn)頭）或者以60 000rpm離心24h（Ti70.1轉(zhuǎn)頭）。普通光照下，在梯ZX可見兩條DNA區(qū)帶， 上部區(qū)帶材料通常較少，由線狀的細(xì)菌（染色體）DNA和帶切口的環(huán)狀質(zhì)粒DNA組成：下部區(qū)帶則由閉環(huán)質(zhì)粒DNA組成。管底部深紅色的沉淀是溴化乙錠RNA復(fù)合物，位于CsCl溶液和石蠟油之間的是蛋白質(zhì)。Beckman Quick-Seal離心管中的CsCl－溴化乙錠梯度可容納4mg 閉環(huán)質(zhì)粒DNA而不至超負(fù)荷。如有更大量的質(zhì)粒存在，將擴(kuò)展為一條寬帶，并與染色體DNA相重疊。這種問題只有在質(zhì)粒復(fù)制達(dá)到極高水平時(shí)才會(huì)出現(xiàn)，只要將該質(zhì)粒提取物分為2個(gè)梯度即可解決。如出現(xiàn)負(fù)荷，可收集整個(gè)DNA區(qū)高產(chǎn)水平時(shí)才會(huì)出現(xiàn)，只要將該質(zhì)粒提取物分為2個(gè)梯度即可解決。如出現(xiàn)超負(fù)荷，可收集整個(gè)DNA區(qū)帶，用CsCl溶液（ρ＝1.58g/ml）將體積調(diào)到15ml，在兩個(gè)離心管中再度離心，使DNA達(dá)到平衡。 6、 收集DNA帶。將21 號(hào)皮下注射針頭插入管的頂端以使空氣進(jìn)入，為盡量減少污染的機(jī)會(huì)，首先用18號(hào)皮下注射針頭按下述方法收集上部的區(qū)帶（雜色體DNA）：用乙醇小心擦拭管外壁以除去任何油脂，然后將一塊Soctch膠帶貼于管外壁。穿過Soctch膠帶將18號(hào)皮下注身針頭（其斜面向上）插入管中，以便使針頭的斜面開口恰好位于染色體DNA區(qū)帶之下并與該區(qū)帶相平行。將粘稠狀DNA收集到一次性使用的管內(nèi)，用造型粘土塊封住皮下注射針頭的末端并將第2根針頭留于原處。 穿過Soctch 膠帶插入第3根皮下注射針頭（18號(hào)），將下部的質(zhì)粒DNA區(qū)帶收集到玻璃或塑料管中。 等密度離心法 1．原理 等密度離心法是在離心前預(yù)先配制介質(zhì)的密度梯度，此種密度梯度液包含了被分離樣品中所有粒子的密度，待分離的樣品鋪在梯度液或和梯度液先混合，離心開始后，當(dāng)梯度液由于離心力的作用逐漸形成底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時(shí)原來分布均勻粒子也發(fā)生重新分布。當(dāng)管底介質(zhì)的密度大于粒子的密度，粒子上?。辉趶濏斕幜Ｗ用芏却笥诮橘|(zhì)密度時(shí)，則粒子沉降，Z后粒子進(jìn)入到一個(gè)它本身的密度位置即粒子密度等于介質(zhì)密變，此時(shí)dr／dt為零粒子不再移動(dòng)，粒子形成純組分的區(qū)帶，與樣品粒子的密度有關(guān)，而與粒子的大小和其他參數(shù)無關(guān)，因此只要轉(zhuǎn)速、溫度不變，則延長離心時(shí)間也不能改變這些粒子的成帶位置。 2．注意點(diǎn)： ①離心時(shí)間要長 ②可用角式轉(zhuǎn)頭或水平式轉(zhuǎn)頭 ③粒子密度相近或相等時(shí)不宜用 ④密度梯度溶液中要包含所有粒子密度 ⑤不能用剎車 四、梯度溶液的制備 (一)梯度材料的選擇原則： 1．與被分離的生物材料不發(fā)生反應(yīng)，且易與所分離的生物材料分開。 2．可達(dá)到要求的密度范圍，且在所要求的密度范圍內(nèi)，粘度低，滲透壓低，離子強(qiáng)度和pH變化較小。 3．不會(huì)對(duì)離心設(shè)備發(fā)生腐蝕作用。 4．容易純化，價(jià)格便宜或容易回收。 5．濃度便于測(cè)定，如具有折光率。 6．對(duì)于分析超迷離心工作來說，它的物理性質(zhì)，熱力學(xué)性質(zhì)應(yīng)該是己知的。 (二)梯度材料的應(yīng)用范圍 下面簡單介紹幾種常用的密度梯度材料的性質(zhì)及其應(yīng)用范圍。 1．蔗糖：水溶性大，性質(zhì)穩(wěn)定，滲透壓較高，其Z高密度可達(dá)1．33g/ml，且由于價(jià)格低，容易制備，是現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室里常用于細(xì)胞器、病毒、RNA分離的梯度材料，但由于有較大的滲透壓，不宜用于細(xì)胞的分離。 2．聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll—400也就是相對(duì)分子重量為400000，F(xiàn)icoll滲透壓低，但它的粘度卻特別高，為此常與泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分離各種細(xì)胞包括血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、鼠肝細(xì)胞等。 3．氯化銫：是一種離于性介質(zhì)、水溶性大，Z高密度可達(dá)1．91g／nd。由于它是重金屬鹽類，在離心時(shí)形成的梯度有較好的分辨率，被廣泛地用于DNA、質(zhì)粒、病毒和脂蛋白的分離，但價(jià)格較貴。 4．鹵化鹽類：KBr和NaCI可用于脂蛋白分離，KI和NaI可用于RNA分離，其分辨率高于銫鹽。NaCl梯度也可用于分離脂蛋白，NaI梯度可分離天然或變性的DNA。 5．Percoll: 是商品名，它是一種SiO2膠體外面包了一層聚乙烯吡咯酮(PVP)，滲透壓低，它對(duì)生物材料的影響小，而且顆粒穩(wěn)定，在冷卻和凍融情況下還是穩(wěn)定的。其粘度高，在酸性pH和高離子強(qiáng)度下不穩(wěn)定。它可用于細(xì)胞、細(xì)胞器和病毒的分離。 五、分析性超速離心 與制備性超速離心不同的是：分析性超速離心主要是為了研究生物大分子的沉降特性和結(jié)構(gòu)，而不是專門收集某一特定組分。因此它使用了特殊的轉(zhuǎn)子和檢測(cè)手段，以便連續(xù)地監(jiān)視物質(zhì)在一個(gè)離心場(chǎng)中的沉降過程。 分析性超速離心的工作原理： 分析性超速離心機(jī)主要由一個(gè)橢圓形的轉(zhuǎn)子，一套真空系統(tǒng)和一套光學(xué)系統(tǒng)所組成。該轉(zhuǎn)子通過一個(gè)柔性的軸聯(lián)接一個(gè)高速的驅(qū)動(dòng)裝置，這軸可使轉(zhuǎn)于在旋轉(zhuǎn)時(shí)形成自己的軸。轉(zhuǎn)子在一個(gè)冷凍的真空腔中旋轉(zhuǎn)，其容納二個(gè)小室：分析室和配衡室有上下二個(gè)平面的石英窗，離心機(jī)中裝有的光學(xué)系統(tǒng)可保證在整個(gè)離心期間都能觀察小室中正在沉降的物質(zhì)，可以通過對(duì)紫外光的吸收(如對(duì)蛋白質(zhì)和DNA)或折射率的不同對(duì)沉降物進(jìn)行監(jiān)視，后一方法的原理是：當(dāng)光線通過一個(gè)具有不同密度區(qū)的透明液時(shí)，在這些區(qū)帶的界面上產(chǎn)生光的折射。在分析室中物質(zhì)沉降時(shí)重粒子和輕粒子之間形成的界面就象一個(gè)折射的透鏡，結(jié)果在檢測(cè)系統(tǒng)的照相底板上產(chǎn)生一“峰”。由于沉降不斷進(jìn)行，界面向前推進(jìn)，故“峰”也在移動(dòng)，從峰移動(dòng)的速度可以得到物質(zhì)沉降速度的指標(biāo)。

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