全部評論(1條)
-
- 穩(wěn)穩(wěn)雯雯98 2017-11-28 00:00:00
- 實驗一、質粒DNA的提取純化與瓊脂糖凝膠電泳 一、實驗目的 掌握質粒DNA提取的基本原理與實驗技能，同時熟悉DNA凝膠成像系統(tǒng)紫外投射儀 利用SDS使細胞膜裂解，同時在堿作用下細菌的線形染色體DNA變性，而質粒DNA（共價閉合環(huán)狀DNA，cccDNA）的二條鏈不會相互分開，當外界條件恢復正常時，線狀染色體DNA片段難以復性，從而與變性的蛋白質和細胞碎片纏繞在一起，而質粒DNA雙鏈又恢復原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中，通過離心將可以將質粒DNA提取出來。DNA制備膜可選擇性地吸附DNA，從而可快速地純化質粒DNA。 瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。實驗室中常規(guī)實驗，一般用瓊脂糖水平凝膠電泳裝置進行DNA電泳。DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的快慢與DNA分子大小、瓊脂糖濃度、DNA分子構象、電流電壓和離子強度等多種因素有關。 DNA的顯色原理為溴化乙啶（EB）或其它染料可嵌入堆積的堿基對之間，在紫外燈下發(fā)熒光。但需注意EB是一種強誘變劑！ 三、實驗材料、儀器與試劑 （一）、實驗材料 含有質粒pBS的DH5(菌株 （二）、實驗儀器 微量移液器， 臺式高速離心機，恒溫振蕩搖床， 高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)，冰箱，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)紫外投射儀 （三）、實驗試劑與配制 小量質粒DNA提取試劑盒 LB液體培養(yǎng)基: 蛋白胨（tryptone）10g， 酵母提取物（yeast extract）5g， NaCl 10g， 用NaOH調至pH7.2-7.5。高壓下蒸汽滅菌20分鐘。 LB固體培養(yǎng)基：每升液體培養(yǎng)基加12g 瓊脂粉，高壓下蒸汽滅菌20分鐘。 氨芐青霉素（Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?TE緩沖液：10mol/L TrisCl (pH8.0)， 1mmol/L EDTA(pH8.0). 高壓蒸氣滅菌15分鐘， 儲存于4 ℃冰箱。 瓊脂糖 5(TBE緩沖液：Tris. 54g， 硼酸27.5g， 加入20ml 的0.5mol/L EDTA(pH8.0)， 定溶至1000ml. 6(上樣緩沖液：0.25% 溴酚蘭， 40%(w/v)蔗糖水溶液。 溴化乙啶（EB）溶液母液：將EB配制成10mg/L，用鋁箔或黑紙包裹容器，儲于溫室即可。 DNA電泳分子量標準（DNA marker）Lambda DNA/EcoRI+HindIII Marker或其它MARker。 四、操作步驟 （一）、質粒DNA的提取純化 diyi次使用時，將試劑盒攜帶的RNaseAl全部加入到S1溶液中，混合均勻，4℃保存。 細菌的培養(yǎng)和收集：將含有質粒pBS的DH5(菌株接種在LB固體培養(yǎng)基（含50(g/ml Amp）中，37℃培養(yǎng)12-24小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5ml LB液體培養(yǎng)基（含 50(g/ml Amp）中，37℃培養(yǎng)約12小時至對數(shù)生長后期。 取1.5ml在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌液，12000rpm離心1min，棄盡上清； 用0.25ml已加入RNaseAl的S1溶液懸浮細菌沉淀，懸浮需均勻，不應留有小的菌塊； 加0.25ml S2溶液，溫和并充分地上下翻轉混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過5 min； 加入0.5ml 4℃預冷的S3溶液，溫和并充分地上下翻轉混合均勻，直至形成緊實的凝集塊，室溫靜置2min。Z高速度(12000rpm)離心5 min； 吸取步驟5中的離心上清并轉移到DNA制備管(置于2ml離心管中)，3600rpm離心l min。如制備管中有液體殘留，適當提高離心速度，再離心1 min，棄濾液； 將制備管置回離心管，加0.5ml Wl溶液，3600rpm離心 30s，棄濾液； 將制備管置回離心管，加0.7ml W2溶液，3600rpm離心30s；以同樣的方法再用0.7ml W 2溶液洗滌一次。棄濾液； 將制備管移入離心管中，12000rpm離心1 min； 將制備管移入新的1.5 ml離心管中，在DNA制備膜正ZY加60μl水或洗脫液，室溫靜置lmin。 12000rpm離心l min洗脫DNA。 （二）、質粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳 稀釋緩沖液的制備：用蒸餾水將5(TBE緩沖液配制成0.5(TBE稀釋緩沖液. 1％瓊脂糖凝膠(TBE稀釋緩沖液，放入微波爐或電爐加熱至瓊脂糖全部熔化，取出混勻。 膠板的制備：將二端封閉的電泳槽置于水平支持物上，插上樣品梳子。在冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入EB溶液至終濃度為0.5(g/ml， 即10mg/ml的母液加2.5ul，混勻。小心地倒入電泳槽中至一定高度。待膠液完全凝固后拔出梳子。然后向槽內(nèi)加0.5(TBE稀釋緩沖液至液
-
贊(17)
回復(0)
熱門問答
- DNA提取有強制性沒有
2017-11-27 00:32:50
532
1
- 外周血白細胞dna提取實驗中為什么沒有rna
2015-11-22 07:50:40
605
2
- DNA提取方法有哪些
2011-05-17 05:40:05
394
4
- DNA提取方法有哪些？
- DNA提取方法有哪些？
2019-08-14 15:41:01
940
1
- dna提取時裂解液中沒有tris會有什么影響
2017-06-01 23:10:14
440
1
- 在 dna提取過程中如果乙醇沒有干燥會出現(xiàn)什么問題
2016-11-20 12:11:34
822
1
- 倉庫內(nèi)要強制性安裝沖淋洗眼器嗎
2018-12-04 02:47:05
384
0
- 油壓傳感器是否為強制性計量器具
- 油壓傳感器是否要辦理計量器具制造許可證... 油壓傳感器是否要辦理計量器具制造許可證 展開
2015-09-01 01:44:53
465
1
- 血樣dna提取方法有哪些
- 我要提人血液DNA，不知道用哪種方法Z好... 我要提人血液DNA，不知道用哪種方法Z好 展開
2010-05-06 02:02:37
568
4
- 植物dna提取方法有哪些?
- 盡可能多的舉幾個例子，
2009-12-05 13:50:25
328
2
- 植物基因組dna提取與其他生物基因組dna提取有何異同
2018-11-22 21:52:44
362
0
- 溫濕度記錄儀是不是國家強制性的計量器具
2017-08-07 00:00:50
418
1
- axygen dna提取試劑盒是否有證
2017-04-29 06:17:45
464
2
- 藍藻細胞DNA提取方法有哪些?
2012-02-26 10:51:00
648
2
- 活性污泥總dna提取方法有哪些
2018-12-05 03:55:48
385
0
- 微生物DNA提取的方法有哪些
2018-12-13 23:15:18
548
0
- DNA提取過程中的注意事項有哪些？
- DNA提取過程中的注意事項有哪些？
2019-08-14 15:56:00
2300
1
- 動植物DNA提取
- 有沒有什么試劑盒或方法，能提取動植物混合物（動物和植物的組織在一起）的DNA？... 有沒有什么試劑盒或方法，能提取動植物混合物（動物和植物的組織在一起）的DNA？ 展開
2018-05-06 09:57:15
672
1
- 植物DNA提取
- 植物與動物基因組DNA提取原理和方法上的差異是什么？... 植物與動物基因組DNA提取原理和方法上的差異是什么？ 展開
2008-03-25 06:52:24
480
3
- DNA提取方法
- 有沒有能同時提取動物和植物DNA的方法？
2018-04-15 13:03:28
414
2
4月突出貢獻榜
推薦主頁
最新話題
滬公網(wǎng)安備 31011502008050號
參與評論
登錄后參與評論