整個(gè)小鼠胚胎的圖像：（左）原始寬場(chǎng)成像結(jié)果和（右）應(yīng)用Large Volume Computational Clearing（LVCC）后的成像結(jié)果。圖片來源：A. Popratiloff和Z. Motahari，美國(guó)喬治·華盛頓大學(xué)。

本文介紹了如何使用THUNDER Imager 3D Cell Culture和Large Volume Computational Clearing（LVCC）對(duì)小鼠胚胎快速、高對(duì)比度成像，實(shí)現(xiàn)了對(duì)軸突生長(zhǎng)和腦神經(jīng)發(fā)育的研究。許多在發(fā)育早期階段損害神經(jīng)回路發(fā)育的遺傳性疾病被認(rèn)為會(huì)對(duì)行為造成干擾。用小鼠模型研究早期神經(jīng)發(fā)育的細(xì)胞變化、定義與人類疾病相似的行為及潛在發(fā)育機(jī)制，是非常困難的。而鑒別發(fā)育的神經(jīng)元回路中三叉神經(jīng)（其參與面部感覺和運(yùn)動(dòng)機(jī)能）軸突生長(zhǎng)的早期分化，使得這些困難迎刃而解。

簡(jiǎn)介

人們普遍認(rèn)為，很多遺傳性疾病都通過損害神經(jīng)回路發(fā)育的早期階段來對(duì)行為產(chǎn)生干擾[1]。事實(shí)證明，在模型動(dòng)物中分辨早期神經(jīng)發(fā)育中細(xì)胞的此類變化具有一定的難度。用與人類遺傳性疾病中臨床顯著缺陷相似的基因突變小鼠模型來定義行為、神經(jīng)回路和潛在發(fā)育機(jī)制，是非常困難的[1]。檢測(cè)單個(gè)神經(jīng)元初始分化中的變化難以實(shí)現(xiàn)。這些挑戰(zhàn)可通過確定發(fā)育的神經(jīng)回路中三叉神經(jīng)這一關(guān)鍵組分的軸突生長(zhǎng)的早期分化來解決[1]。通過著眼于參與面部感覺及運(yùn)動(dòng)機(jī)能如哺乳、進(jìn)食、咬、咀嚼和吞咽等的三叉神經(jīng)（腦神經(jīng)V），以及軸突生長(zhǎng)和原生傳導(dǎo)通路，可以對(duì)使用組織學(xué)處理可能會(huì)缺失的三維環(huán)境進(jìn)行研究[1]。本文介紹如何使用THUNDER Imager 3D Cell Culture和Large Volume Computational Clearing（LVCC）[2,3]對(duì)小鼠胚胎快速、高對(duì)比度成像，以幫助進(jìn)行腦神經(jīng)發(fā)育研究。

挑戰(zhàn)

如要以實(shí)用高效的方式對(duì)整個(gè)小鼠胚胎成像，快速、清晰的高對(duì)比度3D成像解決方案，對(duì)于重要細(xì)節(jié)展示和解析大有益處。相較于激光共聚焦成像，可在很短的時(shí)間內(nèi)一次性采集到完整胚胎的成像結(jié)果。傳統(tǒng)寬場(chǎng)顯微成像速度快，檢測(cè)靈敏度高，但是對(duì)厚標(biāo)本的成像，如小鼠胚胎，通常會(huì)由于非焦平面信號(hào)的影響，呈現(xiàn)模糊的成像結(jié)果，降低圖像對(duì)比度[2,3]。

方法

使用THUNDER Imager 3D Cell Culture對(duì)小鼠胚胎成像。使用抗βIII微管蛋白（Tuj1）抗體對(duì)胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)和腦神經(jīng)進(jìn)行染色。結(jié)合BABB透明化處理，即可對(duì)整個(gè)胚胎中的神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)成像。圖1中的圖像使用數(shù)值孔徑（NA）0.75、工作距離700μm的20x多浸液物鏡采集。該圖像由32個(gè)視野拼接組成，成像深度為672 μm（337層切），采集了完整的胚胎結(jié)構(gòu)。數(shù)據(jù)采集總時(shí)長(zhǎng)為18分鐘。

結(jié)果

通過LVCC和Instant Computational Clearing（ICC）將寬場(chǎng)成像固有的非焦面模糊信號(hào)清除[2,3]。之后，再使用徠卡自適應(yīng)式反卷積技術(shù)來增強(qiáng)三維特征結(jié)構(gòu)的分辨率[4]。這種成像模式便于觀察胚胎的神經(jīng)結(jié)構(gòu)以及胚胎的整體布局中更有價(jià)值的神經(jīng)元定位。

圖1：展示整個(gè)小鼠胚胎的俯視圖，顯示原始數(shù)據(jù)（A）與應(yīng)用LVCC后（B）的差異。根據(jù)相對(duì)物鏡深度進(jìn)行顏色標(biāo)識(shí)的胚胎的角度視圖，其中zui大深度為672 μm。C）應(yīng)用LVCC后的腦部側(cè)視圖，顯示了沿Z軸方向的精密細(xì)節(jié)。圖片來源：Anastas Popratiloff博士和Zahra Motahari博士，喬治·華盛頓大學(xué)納米制造與成像中心（GWNIC），美國(guó)華盛頓特區(qū)。

結(jié)論

與傳統(tǒng)的寬場(chǎng)成像不同，THUNDER技術(shù)Large Volume Computational Clearing（LVCC）[2,3]在對(duì)小鼠胚胎中的腦神經(jīng)發(fā)育成像時(shí)，顯著增強(qiáng)了圖像對(duì)比度，對(duì)精密細(xì)節(jié)有更好的解析。

References：

1.Z. Motahari, T.M. Maynard, A. Popratiloff, S.A. Moody, A.-S. LaMantia, Aberrant early growth of individual trigeminal sensory and motor axons in a series of mouse genetic models of 22q11.2 deletion syndrome, Human Molecular Genetics (2020) vol. 29, iss. 18, pp. 3081-3093, DOI: 10.1093/hmg/ddaa199.

2.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note: THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems.

3.L. Felts, V. Kohli, J.M. Marr, J. Schumacher, O. Schlicker, An Introduction to Computational Clearing: A New Method to Remove Out-of-Focus Blur, Science Lab (2020) Leica Microsystems.

4.V. Kohli, J.M. Marr, O. Schlicker, L. Felts, The Power of Pairing Adaptive Deconvolution with Computational Clearing: Technical Brief, Science Lab (2021) Leica Microsystems. 

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THUNDER Imager 3D Live Cell 和 3D Cell Culture