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  htuopnlianf751 2016-06-09 00:00:00

  一、活細(xì)胞成像系統(tǒng)原理 目前主流的活細(xì)胞成像系統(tǒng)從原理上可以分為兩大類： 基于寬場(chǎng)反卷積技術(shù) 基于共聚焦技術(shù) 兩種技術(shù)作為目前Z流行的活細(xì)胞成像技術(shù)，均可以實(shí)現(xiàn)在維持細(xì)胞存活的情況下，快速獲取單一焦平面的信號(hào)，在具體性能上則各有擅長(zhǎng)。 寬場(chǎng)反卷積技術(shù) 對(duì)光線進(jìn)行反卷積運(yùn)算是光學(xué)成像領(lǐng)域的成熟技術(shù)，Z早由美國(guó)國(guó)家航空航天局開發(fā)并成為觀察微弱天體信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。去卷積和共聚焦技術(shù)是光學(xué)顯微鏡領(lǐng)域獲得單一焦平面光線的兩大主流技術(shù)(J.M.Murray， live cell imaging， 2010)。通過將非焦平面的光線還原至焦平面上，大大提高了樣品信號(hào)的強(qiáng)度以及圖像的信噪比。由于去卷積技術(shù)設(shè)計(jì)到大量的后期運(yùn)算，因此在高性能計(jì)算機(jī)發(fā)明以前，一直受制于運(yùn)算能力，沒有得到大規(guī)模的推廣。隨著近年來(lái)計(jì)算機(jī)性能的大幅提升和價(jià)格的下降，去卷積技術(shù)逐漸成為光學(xué)顯微鏡的主流技術(shù)。一個(gè)點(diǎn)光源經(jīng)過顯微鏡的光路，由于鏡片對(duì)光線的衍射和散射，Z終呈現(xiàn)在觀察者面前的是一個(gè)模糊的點(diǎn)，所以點(diǎn)光源變成模糊的點(diǎn)的過程即為卷積。反卷積就是把模糊的點(diǎn)還原成點(diǎn)光源的過程。 以API 公司的DeltaVision 系統(tǒng)為例，其反卷積過程經(jīng)歷以下幾步： 1)首先通過無(wú)數(shù)的計(jì)算和實(shí)驗(yàn)，得到點(diǎn)光源經(jīng)過顯微鏡物鏡后變模糊的規(guī)律，建立模型。 2)選擇wan美的物鏡，保證樣品信號(hào)經(jīng)過物鏡后變模糊的規(guī)律符合步驟一中得到的模型。 3)將通過顯微鏡光路的所有的光信號(hào)進(jìn)行收集，因?yàn)辄c(diǎn)光源經(jīng)過顯微鏡光路后會(huì)變成一個(gè)空間中的倒圓錐形，所以在收集信號(hào)的時(shí)候需要很準(zhǔn)確的記錄信號(hào)的Z 軸信息。 4)對(duì)收集到的所有光信號(hào)按照步驟一中的模型進(jìn)行還原，Z終將模糊的點(diǎn)還原成清晰的點(diǎn)，客觀反映它在空間的位置和強(qiáng)度。 目前去卷積技術(shù)越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)圖像的研究中。 共聚焦技術(shù) 共聚焦顯微鏡它采用點(diǎn)光源(point lightsource) 照射標(biāo)本，在焦平面上形成了一個(gè)輪廓分明的小的光點(diǎn)(light spot ) ，該點(diǎn)被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到探測(cè)器。探測(cè)器前方有一個(gè)針孔(pinhole) ，幾何尺寸可調(diào)。這樣，來(lái)自焦平面的光，可以會(huì)聚在探測(cè)針孔范圍之內(nèi)，而其它來(lái)自焦平面上方或下方的散射光，都被擋在探測(cè)針孔之外而不能成象。光束掃描器又分為單光束、多光束或狹縫掃描器幾種。其中單光束掃描獲得的圖像質(zhì)量Z好，狹縫掃描器雖然產(chǎn)生圖像的速率很高(可達(dá)實(shí)時(shí)水平) ，但其圖像信噪比低于單光束掃描，這是因?yàn)閺莫M縫長(zhǎng)軸來(lái)的漫射光不能被有效遮擋。多光束掃描如碟片式共聚焦是由電動(dòng)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)Nipkow 盤旋轉(zhuǎn)而實(shí)現(xiàn)的，其熒光量較低，速率一般較高。 寬場(chǎng)反卷積技術(shù)與共聚焦技術(shù)比較表 二、API 高分辨活細(xì)胞成像系統(tǒng)的主要特點(diǎn) DeltaVision 活細(xì)胞成像系統(tǒng)有以下優(yōu)勢(shì)： 1）高靈敏：得益于精密和GX的光路，以及l(fā)ingxian的還原型反卷積技術(shù)，DeltaVision 將寬場(chǎng)顯微鏡的靈敏度和分辨率提高到新的水平，標(biāo)準(zhǔn)配置下Z低可以探測(cè)到13個(gè)GFP 分子，成為目前為止Z靈敏的光學(xué)顯微系統(tǒng)之一。 HIV 病毒通過DC 細(xì)胞和T 細(xì)胞的接觸侵染T 細(xì)胞，綠色顆粒為HIV 病毒 2）高速：標(biāo)配下可達(dá)到 21 幀/秒（512×512）的成像速度。當(dāng)配備EM-CCD 后，Z高可達(dá)到224 幀/秒（64×64），可用于囊泡運(yùn)動(dòng)和鈣火花等快速的生理生化過程觀察。 3）低光毒性：得益于靈敏度的顯著提高，即使微弱的熒光，也可以收集到足夠的信號(hào)，因此激發(fā)光的強(qiáng)度和時(shí)間可以大幅度減少。光損傷和光淬滅不再是活細(xì)胞和微弱熒光觀察的障礙。 4）智能：焦點(diǎn)漂移和細(xì)胞脫離視野是活細(xì)胞觀察的夢(mèng)魘。DeltaVision 特有的自動(dòng)對(duì)焦（autofocus）和細(xì)胞跟蹤（cell tracking）功能，不僅可以自動(dòng)維持焦平面的穩(wěn)定，而且能夠跟蹤移動(dòng)的細(xì)胞，使這些問題迎刃而解，長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)的活細(xì)胞觀察不再困難。 通過對(duì)熒光信號(hào)和細(xì)胞輪廓的識(shí)別，DeltaVision 可以精確的跟蹤需要觀察的細(xì)胞。 5）免維護(hù)：整個(gè)系統(tǒng)無(wú)易損易耗部件，光源壽命在 5000 小時(shí)以上，可正常使用7-10年以上，無(wú)需更換光源和校準(zhǔn)光路。。系統(tǒng)控制和圖形處理基于Linux 操作系統(tǒng)，更適合多線程控制和數(shù)據(jù)處理，不僅大幅度降低了數(shù)據(jù)處理時(shí)間，也避免了在數(shù)據(jù)傳輸過程中感染病毒的危險(xiǎn)。人性化的softWoRX軟件簡(jiǎn)單易用，一個(gè)對(duì)話框內(nèi)即可完成所有的控制操作。 三、API 高分辨活細(xì)胞成像系統(tǒng)的主要功能與應(yīng)用領(lǐng)域 1）多維成像 目前可以做到六維（XYZ 三維，時(shí)間，不同點(diǎn)，不同波長(zhǎng)）成像。通過光學(xué)切片（optical section）技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的3D 觀察，構(gòu)建樣品的立體結(jié)構(gòu)。 經(jīng)過3D 重建的腫瘤細(xì)胞：A 為正面，B 為旋轉(zhuǎn)30 度后，C 為旋轉(zhuǎn)90 度后。 2）3D 還原型反卷積處理 顯微鏡的分辨率和圖像的對(duì)比度取決于物鏡收集的光學(xué)信息。顯微鏡光路中衍射和折射現(xiàn)象的存在，使得樣品信號(hào)的位置和強(qiáng)度都發(fā)生了變化，降低了系統(tǒng)的分辨率和圖像的質(zhì)量。API 作為對(duì)圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行反卷積處理Z早的實(shí)踐者，將顯微鏡的硬件設(shè)計(jì)和后期軟件處理wan美的結(jié)合在一起，通過對(duì)光學(xué)信號(hào)的3D 還原型反卷積處理，大大提高了顯微鏡的靈敏度和分辨率。 原始圖像和經(jīng)過3D 反卷積處理后圖像的對(duì)比：A，B 為處理前，C，D 為處理后。 經(jīng)過反卷積處理后，信號(hào)的強(qiáng)度和圖像對(duì)比度得到很大提升。 3）延時(shí)攝影 通過軟件精確的控制，拍攝的時(shí)間間隔從數(shù)秒到數(shù)小時(shí)不等，在長(zhǎng)時(shí)間拍攝下也不會(huì)造成熒光信號(hào)的淬滅。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求的不同，無(wú)論單一層面還是3 維結(jié)構(gòu)，都可以獲得良好的效果。 正在分裂的Hela 細(xì)胞，其中綠色標(biāo)記微管蛋白，紅色標(biāo)記染色體 4）高速離子成像 結(jié)合高速 CCD 和GX的光路，在512×512 像素下仍然可以實(shí)現(xiàn)21 幀/秒的成像速度。對(duì)于快速的離子濃度的變化，Z快可以50-100 幀/秒的速度獲取圖像。 細(xì)胞間鈣信號(hào)的傳遞。使用Fluo‐3 標(biāo)記胞內(nèi)的鈣離子，并給予熒光信號(hào)對(duì)鈣離子的強(qiáng)度進(jìn) 5．熒光共定位分析 通過比較多個(gè)熒光通道的定位情況，即可知道他們?cè)诳臻g上和時(shí)間上的分布信息，進(jìn)而得到相應(yīng)的熒光信號(hào)是否存在相互作用、協(xié)同運(yùn)動(dòng)、定向運(yùn)輸?shù)取? 體外重組的病毒顆粒侵染細(xì)胞，綠色標(biāo)記病毒的殼蛋白，紅色標(biāo)記病毒的RNA結(jié)合蛋白。病毒入侵前，由于病毒顆粒完整，綠色信號(hào)和紅色信號(hào)共定位。病毒入侵細(xì)胞后，脫掉表面的殼蛋白，綠色信號(hào)和紅色信號(hào)分離。 6）熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET） DeltaVision 特制的活細(xì)胞濾片組保證CFP/YFP，GFP/mcherry（RFP）熒光強(qiáng)度的精確記錄，并進(jìn)一步計(jì)算出蛋白對(duì)之間精確的能量轉(zhuǎn)移系數(shù)。 計(jì)算不同熒光通道熒光信號(hào)的強(qiáng)度，進(jìn)一步可得到能量轉(zhuǎn)移系數(shù)。 主要應(yīng)用領(lǐng)域： 1）細(xì)胞遷移與細(xì)胞骨架； 2）細(xì)胞分裂與細(xì)胞周期； 3）細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)； 4）組織分化與發(fā)育； 5）囊泡和蛋白運(yùn)輸； 6）生理學(xué)和神經(jīng)科學(xué)； 7）鈣離子信號(hào)研究； 8）蛋白質(zhì)與DNA 的相互作用； 9）宿主與病原體相互作用； 10）癌癥研究； 11）藥理研究； 12）生物物理研究。

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