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  氿皋飛鶴 2008-09-27 00:00:00

  Sanger法

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  5300110 2008-09-27 00:00:00

  打質(zhì)譜。

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  位heart 2016-12-02 01:29:35

  測定肽或蛋白質(zhì)中各氨基酸的排列順序 在分析氨基酸后下一步就是要測定肽鏈或蛋白質(zhì)中氨基酸的結(jié)合順序，通常可由下列幾種方法配合使用分析推測出來： （1）N-端氨基酸單元的分析：Z常用的有下列兩種方法： （a）桑格爾方法： 詳細(xì)內(nèi)容 這項(xiàng)方法首先是桑格爾（Sauger，F(xiàn)．）提出的，他利用氨基很容易和2，4-二硝基氟氯苯（DNP）發(fā)生芳香親核取代反應(yīng)，如用一個肽和2，4-二硝基氟苯反應(yīng)，顯然鍵的N-端游離氨基和它反應(yīng)，然后把這個N-端帶有2，4-二硝基苯基的肽鏈徹底水解，在水解物中，只有一個氨基酸的α-氨基的氫被DNP取代，各種氨基酸的DNP標(biāo)記化合物都是黃色的，并且都各有一個Rf值，因此很容易鑒別；所以通過這個方法，很容易辨認(rèn)出肽中的N-端是哪一個氨基酸。 （b）艾德滿方法： 詳細(xì)內(nèi)容 另一種標(biāo)記N-端的氨基方法叫作文德滿（Edman.P.）方法，用異硫氰酸苯酯和N-端的氨基反應(yīng)，生成苯胺基硫代甲酸衍生物。該化合物在無水氯化氫作用下，發(fā)生一種關(guān)環(huán)作用，形成一個苯基乙內(nèi)酰硫脲的衍生物，從肽鏈上斷裂下來，而肽鏈中的酰氨鍵不受影響。 一個肽鏈經(jīng)上列的反應(yīng)后，其結(jié)果是失去一個N-端的氨基酸，這個氨基酸可以作為取代苯基乙內(nèi)酸硫脲進(jìn)行鑒定。失去一個氨基酸的肽鍵還可以收回，再重復(fù)上面的反應(yīng)，進(jìn)行第二個N-端的標(biāo)記。這種方法已經(jīng)可以自動化。假若肽鍵不是太長的話，一般講這個方法是可靠的。 （2）c-端氨基酸單元的分析： c-端的氨基酸單元可以通過羧肽酶催化水解，羧肽酶可以選擇性切斷游離羧基相鄰的肽鍵，在溶液中切斷下來的氨基酸是C-端位置的，已切斷了c-端氨基酸的肽鍵。再與羧肽酶作用，如此不斷進(jìn)行，可以使整個多肽或蛋白質(zhì)水解為氨基酸。根據(jù)氨基酸出現(xiàn)的時間，可以推斷C-端氨基酸的排列順序。實(shí)際上此法Z多只能鑒定3～4個氨基酸，因此對于長鏈用處不大，可用于小肽（二肽、三肽等）C-端氨基酸順序鑒定。 （3）用酶催化使肽鍵部分水解: 測定肽鍵氨基順序的一個關(guān)鍵是部分分解，將一個長的肽鍵分解為許多小肽，然后將這些小肽分離，再進(jìn)行氨基酸分析，N-端基標(biāo)記，這樣多次地重復(fù)下去，Z終得到整個肽鏈氨基酸的順序。許多消化道內(nèi)分泌出來的酶可以使肽鍵水解。有些酶的專一性并不很強(qiáng)，但是有些酶的水解是具有高度專一性的，不同的酶只能分解不同氨基酸的肽鍵。

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