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  hn328812 2008-09-22 00:00:00

  實驗三：葉綠體色素提取分離與理化性質(zhì)及含量測定 （一）實驗?zāi)康募耙饬x （二）實驗原理 （三）實驗步驟 （四）實驗報告 0/0/00 2 實驗?zāi)康暮鸵饬x 因此，測定葉綠素含量便成為研究光合作用與氮代謝必不可少的手段，在作物育種、科學(xué)施肥、看葉診斷中有著廣泛的應(yīng)用 綠色植物的光合作用是在葉綠體中的葉綠體色素中進(jìn)行的，了解葉綠體色素的組成、性質(zhì)及測定對于理解光合作用的本質(zhì)很有幫助。 0/0/00 3 葉綠體在細(xì)胞中運動視頻 0/0/00 4 葉綠體在細(xì)胞中的分布與結(jié)構(gòu) 0/0/00 5 類囊體膜的結(jié)構(gòu)及功能 0/0/00 6 實驗原理 植物葉綠體色素是吸收太陽光能，進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)。它一般由葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素組成。這些色素都不溶于水，而溶于有機(jī)溶劑，故可用乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑提取。 0/0/00 7 實驗原理 葉綠素是一種二羧酸——葉綠酸與甲醇和葉綠醇形成的復(fù)雜酯，故可與堿起皂化反應(yīng)而生成醇（甲醇和葉綠醇）和葉綠酸的鹽，產(chǎn)生的鹽能溶于水中，可用此法將葉綠素與類胡蘿卜素分開。 色素分離的方法有多種，紙層析是Z簡便的一種。當(dāng)溶劑（有機(jī)推動劑）不斷從紙上流過時，由于混合物（葉綠素提取液）中各種成分在固定相（濾紙纖維素所吸附的水分）和流動相（有機(jī)推動劑）間具有不同的分配系數(shù)，所以移動速度不同，經(jīng)過一定時間后，可將各種色素分開。 0/0/00 8 實驗原理 葉綠素中的鎂可以被氫離子所取代而成褐色的去鎂葉綠素。去鎂葉綠素遇銅則成為銅代葉綠素，銅代葉綠素很穩(wěn)定，在光下不易破壞，故常用此法制作綠色多汁植物的浸漬標(biāo)本。 葉綠素與類胡蘿卜素都具有光學(xué)活性，表現(xiàn)出一定的吸收光譜，可用分光光度計精確測定。葉綠素吸收光量子而轉(zhuǎn)變成激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，當(dāng)它變回到基態(tài)時可發(fā)射出紅光量子，因而產(chǎn)生熒光。葉綠素的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，容易受強(qiáng)光的破壞，特別是當(dāng)葉綠素與蛋白質(zhì)分離以后，破壞更快，而類胡蘿卜素則較穩(wěn)定。 0/0/00 9 實驗步驟(1) 今欲測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三個特定波長下的吸光度D，并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。 Ca=12.7D663 –2.69 D645（3） Cb=22.9 D645 –4.68D663（4） Ck=4.7D440- 0.27Ca+b 根據(jù)朗伯一比爾定律，某有色溶液的吸光度D與其中溶液濃度C和液層厚度L成正比，即： D＝KCL D：吸光度，即吸收光的量，C：溶液濃度， K：為比吸收系數(shù)（吸光系數(shù)）， L：液層厚度，通常為1cm. 如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長下吸光度的總和，這就是吸光度的加和性。 0/0/00 10 實驗材料和器材 器材：721型分光光度計、電子天平、量筒、研缽、剪刀、漏斗、濾紙、移液管（1mL）、試管及試管架、洗耳球、酒精燈等。 試劑：丙酮、80%丙酮、醋酸酮、5%鹽酸、碳酸鈣、石英砂等 實驗材料 鹵地菊葉片 0/0/00 11 實驗步驟(1) 分離：在大試管中加入推動劑，然后將濾紙固定于膠塞的小鉤上，插入試管中，使浸入溶劑內(nèi)（色點要高于葉面，濾紙條邊緣不可碰到試管壁），蓋緊膠塞，直立于陰暗處層析。 當(dāng)推動劑前沿接近濾紙邊緣時，取出濾紙，風(fēng)干，觀察色帶的分布。葉綠素a為藍(lán)綠色，葉綠素b為黃綠色，葉黃素為黃色，胡蘿卜素為橙黃色。用鉛筆標(biāo)出各種色素的位置和名稱。 1.葉綠體色素的提取 （1）取植物新鮮葉片1克，洗凈，擦干，去掉中脈剪碎，放人研缽中。 （2）研缽中加入少量石英砂及碳酸鈣粉，2-3 mL95%乙醇，研磨至糊狀，再加2-3 mL95％乙醇，過濾，即得色素提取液。 2.葉綠體色素的分離 點樣：取前端剪成三角形的濾紙條，用毛細(xì)管取葉綠素提取液，如圖點樣于“色點”處，注意每次所點溶液不可過多，點樣后晾干，再重復(fù)操作數(shù)次。 0/0/00 12 理化性質(zhì)測定 2.氫和銅對葉綠素分子中鎂的取代作用 方法一；取兩支試管。diyi支試管加葉綠體色素提取液2mL，作為對照。第二支試管加葉綠體色素提取液2 mL，再加入稀鹽酸1滴，搖勻，觀察溶液顏色變化。當(dāng)溶液變竭后，再加入少量醋酸銅粉末，微微加熱，觀察記錄溶液顏色變化情況，并與對照試管相比較。解釋其顏色變化原因。 將上一個實驗中提取的葉綠體色素溶液適當(dāng)稀釋后，進(jìn)行以下實驗： 1.熒光現(xiàn)象的觀察。 取l支試管加入濃的葉綠體色素提取液，在直射光下觀察溶液的透射光與反射光顏色有何不同，可觀察到反射出暗紅色的熒光。 0/0/00 13 理化性質(zhì)測定 2.氫和銅對葉綠素分子中鎂的取代作用 方法一；取兩支試管。diyi支試管加葉綠體色素提取液2mL，作為對照。第二支試管加葉綠體色素提取液2 mL，再加入稀鹽酸1滴，搖勻，觀察溶液顏色變化。當(dāng)溶液變竭后，再加入少量醋酸銅粉末，微微加熱，觀察記錄溶液顏色變化情況，并與對照試管相比較。解釋其顏色變化原因。 將上一個實驗中提取的葉綠體色素溶液適當(dāng)稀釋后，進(jìn)行以下實驗： 1.熒光現(xiàn)象的觀察。 取l支試管加入濃的葉綠體色素提取液，在直射光下觀察溶液的透射光與反射光顏色有何不同，可觀察到反射出暗紅色的熒光。 0/0/00 14 理化性質(zhì)測定 4. 葉綠體色素吸收光譜曲線 將上述葉綠體色素提取液注入1cm比色杯中，另取95%乙醇作空白，于400-700nm之間，每間隔10nm讀取光密度值。根據(jù)測定結(jié)果，以波長為橫坐標(biāo)繪制曲線，此即葉綠體色素的吸收光譜曲線。用同樣的方法測定皂化作用中分離出綠色素與黃色素的吸收光譜曲線，并對結(jié)果進(jìn)行分析。 3.皂化作用（綠色素與黃色素的分離） 取葉綠體色素提取液2 mL于大試管中，加入4mL，搖勻，再沿試管壁慢慢加人3～6mL蒸餾水，輕輕混勻，靜置片刻，溶液即分為兩層，色素已全部轉(zhuǎn)入上層中。用滴管吸取上層綠色層溶液，放入另一試管中，再用蒸餾水沖洗一、二次。在色素溶液中加入30％KOH－甲醇溶液，充分搖勻，再加入蒸餾水約3 mL，搖勻靜置。可以看到溶液逐漸分為兩層，下層是水溶液，其中溶有皂化的葉綠素a和b，上層是溶液，其中溶有黃色的胡蘿卜素和葉黃素。將上下層放入兩試管中，可供觀察吸收光譜用。 0/0/00 15 含量測定 (3）轉(zhuǎn)移到25mL棕色容量瓶中，用少量80％丙酮沖洗研缽、研棒及殘渣數(shù)次，Z后連同殘渣一起倒入容量瓶中。Z后用80％丙酮定容至25mL，搖勻。離心或過濾。 (4）將上述色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)。以80％丙酮為空白，在波長663nm、645nm、652nm和440nm下測定光密度。 （1）取新鮮植物葉片，擦凈組織表面污物，剪碎，混勻。 （2）稱取剪碎的新鮮樣品0.5g，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2～3mL80％丙酮，研成勻漿，再加80％丙酮5mL，繼續(xù)研磨至組織變白。 0/0/00 16 0/0/00 17 0/0/00 18 四、實驗結(jié)果計算 將測得的光密度值代入公式，分別計算葉綠素a、b、a+b和類胡蘿卜素的濃度（mg／L）。 并按下式計算組織中單位鮮重或干重的各色素的含量： 色素濃度（mg／L）×提取液總體積×稀釋倍數(shù) 色素在葉片中的含量（%）= × 樣品重量（mg）×1000 稀釋倍數(shù)：若提取液未經(jīng)稀釋，則取1 0/0/00 19 實驗報告 1.試述葉綠體色素的吸收光譜特點及生理意義。 2.在皂化反應(yīng)中加入有什么作用？

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