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  af05522 2016-01-28 00:00:00

  DNA 復(fù)制有關(guān)酶 DNA引發(fā)酶(PRIMASE) 是DNA合成中合成RNA引物的酶，引發(fā)酶行使2個(gè)功能:首先在起點(diǎn)處起始先導(dǎo)鏈的合成.其二在延伸中幫助崗奇片段的反復(fù)起始. DNA解旋酶 DNA 單鏈結(jié)合蛋白(SSB) 核酸酶(nucleases) 是通過(guò)水解消化核酸的酶，包括DNase 和 RNase兩類，各類還包括外切酶和內(nèi)切酶兩類.在復(fù)制中需要三個(gè)特定的核酸酶活性:校正需要3'-5'的外切酶活性，引物的去除需要RNaseH，5'-3'外切酶活性. 是在雙鏈DNA中催化相鄰核苷酸形成的酶.她要求5'斷的核苷酸必須有完整的磷酸基團(tuán)，3'端必須有完整的羥基.在真核生物中連接酶需要ATP.控制所有DNA修復(fù)途徑的Z后階段，哺乳動(dòng)物有4種連接酶活性，DNA連接酶I是涉及后滯鏈修復(fù)的基本酶. 非洲爪蟾卵提取物中MCM2-7復(fù)合物 在染色質(zhì)上復(fù)制起始復(fù)合物周圍的分布 摘要:MCM2-7復(fù)合物被認(rèn)為具有真核生物解旋酶功能.它通過(guò)復(fù)制起始復(fù)合物(ORC)，CDc6，Cdt1而結(jié)合到DNA 鏈上，它在G1-S的過(guò)度期被CDc45和蛋白質(zhì)激酶CDc7，Cdk2所激活.但是，在染色體上，結(jié)合的MCM復(fù)合物數(shù)量遠(yuǎn)比ORC復(fù)合物的數(shù)量多.為了弄清楚原因，本實(shí)驗(yàn)用非洲爪蟾(XENOPUS)卵提取物為材料，檢測(cè)了結(jié)合在線性DNA片段上的各種蛋白質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DNA片段為80bp時(shí)，ORC和MCM之比為1:1;當(dāng)DNA片段較長(zhǎng)時(shí)，MCM的比率迅速上升，證明MCM廣泛分布在結(jié)合有CDc45的DNA周圍.MCM復(fù)合物并不是的限制物， 摘要(續(xù)) 它們?cè)贑Dc7存在的情況下被磷酸化，他們能誘導(dǎo)Cdk2 依賴的CDc45的附著.非洲爪蟾卵提取物實(shí)驗(yàn)表明，的起始包含著復(fù)雜的，分布廣泛的，具有起始作用的MCM2-7復(fù)合物. 染色體需要三個(gè)系統(tǒng)參與 非洲爪蟾胚胎期細(xì)胞從末期至G1期末復(fù)制起始事件 固定在線性DNA碎片上的前復(fù)制復(fù)合物的形成和激活 ORC和MCM被有效地富集于82-bp以上的DNA片段上 MCM的附著與DNA長(zhǎng)度有關(guān)，而ORC與DNA長(zhǎng)度無(wú)關(guān) 側(cè)位MCM復(fù)合物緊緊附著于染色質(zhì) 附著于DNA上的CDC45是DNA復(fù)制的速度限制因素 MCM復(fù)合物的磷酸化是CDC7依賴的 CDC45在染色體上的附著受所促進(jìn) DNA復(fù)制起始模型 結(jié)論 一，MCM復(fù)合物的附著需要82bp的DNA片段，ORC的附著也需要80bp的DNA片段，被認(rèn)為是G1期MCM附著所需的DNA長(zhǎng)度. 二，DNA片段長(zhǎng)度超過(guò)82bp時(shí)，MCM復(fù)合物的數(shù)量顯著增加，而ORC保持不變;MCM復(fù)合物廣泛分布在ORC周圍的DNA片段上. 三，MCM復(fù)合物在DNA片段上的附著需要CDC6和CDT1. 在沒有ORC，CDC6，CDT1存在的DNA片段上沒有MCM附著. 四，MCM復(fù)合物附著后，ORC去除不會(huì)降低DNA合成的效率.ORC后的MCM具有支持復(fù)制起始的作用 結(jié)論(續(xù)) 五，側(cè)位MCM復(fù)合物被CDC7結(jié)合，MCM4被CDC7依賴的反應(yīng)磷酸化;在存在的情況下，CDC45:MCM約為1，表明每個(gè)側(cè)位MCM可以招募一個(gè)CDC45. 六，DNA復(fù)制的起始事件被有規(guī)律地隔斷，其原因是在CDC45附著的一定距離的MCM復(fù)合物處于不活動(dòng)狀態(tài). 七，研究表明，MCM復(fù)合物在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中普遍存在，人類的細(xì)胞核中有106個(gè)MCM復(fù)合物;ZG倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中MCM復(fù)合物在G1期增多，在GI/S期的過(guò)度期達(dá)到Z高. 細(xì)胞周期是指由細(xì)胞分裂結(jié)束到到下次細(xì)胞分裂結(jié)束的時(shí)期.有增殖能力的細(xì)胞每增殖一次都要經(jīng)過(guò)一個(gè)細(xì)胞周期.每個(gè)細(xì)胞周期都要經(jīng)過(guò)間期和分裂期.真核細(xì)胞間期又分為G1期，S期和G2期，分裂期有分為前期，中期，后期，末期.GI期早期如果生長(zhǎng)因子缺乏，細(xì)胞進(jìn)入靜止期G0期，如果細(xì)胞通過(guò)限制點(diǎn)(R)，就進(jìn)入下一輪復(fù)制和分裂.左圖反映細(xì)胞成分的持續(xù)積累和DNA的非持續(xù)合成. 細(xì)胞周期的分子基礎(chǔ)是一系列蛋白質(zhì)和激酶所調(diào)控的. 連續(xù)精確的DNA合成需要很多酶活性協(xié)同作用.其中在復(fù)制叉中使DNA延伸的Z重要的是細(xì)胞復(fù)制體復(fù)合物，它是酶和其他蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)復(fù)合物. 真核細(xì)胞有四種細(xì)胞核和一種負(fù)責(zé)細(xì)胞器DNA基因組復(fù)制的多聚酶.α δ 負(fù)責(zé)染色體的復(fù)制， α 在后滯鏈上延伸RNA引物，為復(fù)制因子(RF-C)提供模板.DNA聚合酶δ合成先導(dǎo)鏈和后滯鏈，它與PCNA(增殖細(xì)胞核抗原)結(jié)合.DNA聚合酶β 是5個(gè)酶中Z小的酶，其保真度和行進(jìn)性Z低，它涉及DNA的修復(fù).DNA聚合酶γ 負(fù)責(zé)線粒體NDA的復(fù)制.DNA聚合酶ε的作用不十分清楚. DNA解旋酶是沿單鏈DNA移動(dòng)的酶，它利用ATP水解得來(lái)的能量打斷氫鍵，分離雙鏈分子.它只沿DNA一個(gè)方向移動(dòng)，可根據(jù)他們5'-3'或3'-5'的極性分類.RF復(fù)制因子. DNA是催化DNA拓?fù)洚悩?gòu)體相互轉(zhuǎn)換的酶.在真核細(xì)胞中，是細(xì)胞骨架的一部分，他們?cè)谥薪忝萌旧w的分離也起作重要作用.拓?fù)洚悩?gòu)酶分成兩類功能類型:I 型只剪切一條鏈，只能連接/去處含有缺口的地物.II 型可以同時(shí)剪切兩條鏈，可以連接/剪切共價(jià)閉環(huán)鏈. 單鏈結(jié)合蛋白是缺乏酶活性的復(fù)制輔助蛋白，但是其他復(fù)制有關(guān)酶所必需的.它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)行使很多涉及單鏈區(qū)域穩(wěn)定性的功能，在復(fù)制中包括穩(wěn)定溶解起點(diǎn)，維持螺旋酶活性，從DNA模板上去除二級(jí)結(jié)構(gòu)，YZ核酸酶活性等.Pol:聚合酶，ss釀酒酵母，RP-A1是釀酒酵母基因. CDC 蛋白 CDK 依賴激酶 MCM 釀酒酵母轉(zhuǎn)錄因子， 該圖顯示一小段染色體DNA片段如何跨過(guò)細(xì)胞周期. diyi系統(tǒng):起始識(shí)別系統(tǒng).該系統(tǒng)負(fù)責(zé)在DNA適當(dāng)?shù)奈恢脧?fù)制起點(diǎn).充當(dāng)這一角色的是ORC，它被附吸在復(fù)制起始處，并行使起始功能，在這個(gè)間期ORC都結(jié)合在DNA上. 第二系統(tǒng):復(fù)制準(zhǔn)許系統(tǒng).他保證這些"起始"在一個(gè)細(xì)胞周期僅激活一次.他在M期末激活，并支持MCM2-7復(fù)合物的附著，準(zhǔn)許進(jìn)入S期開始復(fù)制. 第三系統(tǒng):S期促進(jìn)因子(SFP).提供復(fù)制叉起始的觸發(fā)器.他包括2種活性成分: CDc7蛋白質(zhì)激酶，S期促進(jìn)的細(xì)胞周期依賴激酶CDK. 蛋白質(zhì)印跡法分析 (主要了解DNA和ORC，MCM的空間關(guān)系) 1道:當(dāng)量的磁珠(未加DNA)，檢測(cè)不出MCM和ORC2 2-6道:磁珠被偶聯(lián)到3kb的DNA藍(lán)印碎片(通過(guò)PCR得來(lái))上.然后和非洲爪蟾卵細(xì)胞溶質(zhì)保溫20分鐘，通過(guò)分離，洗滌再用蛋白質(zhì)印跡法分析. 2道表明有DNA片段存在時(shí)，能檢測(cè)到MCM和ORC2 4道表明，加入GEMININ時(shí)，不能檢測(cè)到MCM3(被YZ與瓷珠結(jié)合)說(shuō)明MCM的附著是CDT1依賴的. 5道表明，NPE存在時(shí)CDc45與瓷珠結(jié)合增加. 6道表明，P27KIP存在時(shí)，CDc45檢測(cè)不到，因?yàn)镃DK2受到Y(jié)Z，因而c45的附著需要CDK2. 了解ORC，MCM和DNA長(zhǎng)度的關(guān)系 #A&B:一個(gè)251 bp的PCR產(chǎn)物跨越藍(lán)印多接頭被偶聯(lián)到bead上， beads被不同的酶消化，產(chǎn)生251，154，120，94，67，和0 bp的DNA片段.消化后的DNA片段附著于bead上進(jìn)行2%瓊脂電泳分析(A)或與非洲爪蟾卵細(xì)胞溶質(zhì)保溫，然后附著于蛋白質(zhì)上，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法分析(B).(C)相同計(jì)量的DNA beads和非洲爪蟾卵細(xì)胞溶質(zhì)保溫(1-5加緩沖液，6-10加Geminin)然后用蛋白質(zhì)印跡法分析. (D)通過(guò)定量對(duì)比發(fā)現(xiàn)，67 bp的DNA上沒有MCM.94個(gè)bp時(shí)，MCM:OCR=1:1. (D)進(jìn)一不了解到82個(gè)bp時(shí)是MCM附著的Z短片段. A表明，在0.3-6kb時(shí)，ORC的數(shù)量都沒有變化，研究表明，10-15kb有一個(gè)ORC.另一方面，MCM3確隨著DNA片段的延長(zhǎng)含量顯著增加.Geminin完全YZMCM在DNA上的附著，但卻加強(qiáng)ORC在DNA上的附著，切附著量隨DNA片段的增加而增加. B表明6kbDNA片段上，MCM3:ORC2與精子細(xì)胞中的一樣高，約20-40:1. C是為了解MCM2-7的其他亞基是否也和MCM3一樣而設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn).首先偶聯(lián)一個(gè)1kb的PCR產(chǎn)物在瓷珠上.一份被消化到100bp長(zhǎng)度，一份不消化.結(jié)果表明:附吸到DNA片段上的ORC2在1kb和 100bp上相近.MCM3在100bp上低得多.MCM7和MCM4表現(xiàn)和MCM3一致.表明MCM2-7都是DNA長(zhǎng)度依賴的. D是了解在1kb上MCM3和ORC2的比例.用的是蛋白質(zhì)印跡法.光密度計(jì)量法結(jié)果是11:1.暗示每個(gè)MCM3所需的DNA長(zhǎng)度是90bp 該實(shí)驗(yàn)是要了解ORC前和ORC后MCM2-7復(fù)合物與DNA的相互作用是否通過(guò)同樣的機(jī)制.實(shí)驗(yàn)是通過(guò)比較在僅含ORC后MCM復(fù)合物(6kb)和僅含ORC前MCM復(fù)合物(100bp)的兩個(gè)片段上MCM復(fù)合物的附著堅(jiān)固程度. 將他們防入1M KCL，發(fā)現(xiàn)無(wú)論1kb還是100bpDNA上，MCM復(fù)合物都被阻止與DNA結(jié)合，而ORC在0.6M KCL溶液中被阻止與DNA結(jié)合.試驗(yàn)結(jié)果與用精子DNA試驗(yàn)結(jié)果一致.表明ORC前后的MCM復(fù)合物都是鹽抗的. C表明:CDC-45與DNA長(zhǎng)度沒有關(guān)系.它是CDK-2依賴的.ORC2不依賴DNA片段長(zhǎng)度. 實(shí)驗(yàn)表明只有一個(gè)MCM亞基對(duì)CDC45的附著起作用. 實(shí)驗(yàn)要了解多少數(shù)量的MCM復(fù)合物在精子染色體上招募的CDC45，使DNA模板在非洲爪蟾卵細(xì)胞完全復(fù)制.先要了解在精子細(xì)胞染色體中MCM3，ORC2和CDC45的比率.蛋白質(zhì)印跡法，用已知量的CDC45，ORC2和MCM3做對(duì)照(A). B是了解CDC45是否是DNA復(fù)制速率的限制因素.結(jié)果表明，DNA復(fù)制速率與CDC45的量有關(guān)，與CDC45在染色體上的附著情況有關(guān). C非洲爪蟾卵細(xì)胞核的組裝和復(fù)制與MCM復(fù)合物無(wú)關(guān).是否與徑自細(xì)胞的DNA復(fù)制也無(wú)關(guān) 結(jié)果顯示:在MCM復(fù)合物下降到50%時(shí)，附著到DNA上的MCM開始下降，到6%時(shí)就無(wú)法檢測(cè)到.但加入NPE時(shí)，DNA復(fù)制與MCM濃度無(wú)關(guān). 以往的研究表明:附著于染色體上的MCM4的磷酸化是通過(guò)CDK2依賴的蛋白質(zhì)激酶實(shí)現(xiàn)的;非洲爪蟾卵抽提物中附著于染色體上的MCM4的磷酸化是在加入NPE后，且需要CDC7存在. 圖6是精子細(xì)胞染色體，含MCM3:ORC2為20:1(6道).MCM4在加入NPE后4分鐘全部磷酸化(2道).其結(jié)果與CDC7與側(cè)位MCM2-7復(fù)合物的相互作用一致.證明結(jié)合于DNA上的MCM是被CDC7引導(dǎo)和修飾的. MCN2-7復(fù)合物磷酸化被CDC45促進(jìn)，但僅少量MCM復(fù)合物招募CDC45.是否所有的MCM復(fù)合物都被CDC45磷酸化 實(shí)驗(yàn)試圖尋找在什么條件下，大多數(shù)MCM復(fù)合物都要招募CDC45.結(jié)論是:大多數(shù)MCM復(fù)合物與CDC45相互作用，CDC45的附著是CDK2，MCM2-7和CDC7依賴的.因此MCM復(fù)合物是支持復(fù)制起始的.

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