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  敏姐是個(gè)好人0 2017-01-25 00:00:00

  這是因?yàn)榛蚪M文庫(kù)的基因和cDNA的基因不會(huì)同時(shí)出現(xiàn)（可以理解為：基因組文庫(kù)的目的基因產(chǎn)生基因mRNA后，只提煉該mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。此時(shí)的目的基因已經(jīng)不在提取液中了，所以限制酶不會(huì)對(duì)其有作用）。cDNA產(chǎn)生的步驟如下： 1） cDNA diyi鏈的合成：用親和層析法得到 mRNA 后，根據(jù) mRNA 分子的 3' 端有 poly (A) 尾結(jié)構(gòu)的原理，用 12~20 個(gè)核苷酸長(zhǎng)的 oligo （ dT ）與純化的 mRNA 混合， oligo （ dT ）會(huì)與 poly (A) 結(jié)合作為反轉(zhuǎn)錄酶的引物，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的產(chǎn)物是一條 RNA-DNA 的雜交鏈。 oligo （ dT ）結(jié)合在 mRNA 的 3' 端，因此合成全長(zhǎng)的 cDNA 需要反轉(zhuǎn)錄酶從 mRNA 分子的一端移動(dòng)到另一端，有時(shí)這種全合成難以達(dá)到，尤其是 mRNA 鏈很長(zhǎng)時(shí)，為此建立了一種隨機(jī)引物法合成 cDNA 。隨機(jī)引物是一種長(zhǎng)度為 6~10 個(gè)核苷酸，由 4 種堿基隨機(jī)組成的 DNA 片段。與 oligo （ dT ）僅與 mRNA 3' 端結(jié)合不同，它們可以在 mRNA 的不同位點(diǎn)結(jié)合。隨機(jī)引物法合成的產(chǎn)物也是 RNA-DNA 的雜交體。把 cDNA 克隆到載體中之前，必須把這種雜交體中的 RNA 轉(zhuǎn)變成 DNA 鏈，即形成雙鏈 DNA 分子。 2）. 雙鏈 cDNA 的合成：合成 cDNA 第二條鏈有兩種方法。一種方法是利用 cDNA diyi鏈的 3' 末端常常出現(xiàn)發(fā)夾環(huán)的特征，這種發(fā)夾結(jié)構(gòu)是反轉(zhuǎn)錄酶在diyi鏈末端“返折”并且進(jìn)行復(fù)制diyi鏈的結(jié)果，它為合成 cDNA 第二鏈提供了有用的引物。用這種方法合成的雙鏈 cDNA 在一端有一個(gè)發(fā)夾環(huán)，可以用單鏈特異的 S1 核酸酶切去。但是 S1 核酸酶的處理，常常會(huì)“修剪 ” 過(guò)多的 cDNA 順序，使 cDNA 丟失了 mRNA 5' 端的部分順序。 另一種方法是用大腸桿菌的 RNase H 進(jìn)行修飾。 RNase H 能識(shí)別 RNA-DNA 雜交分子并把其中的 RNA 切割成短的片段，這些 RNA 短片段仍與 cDNA diyi鏈結(jié)合，可被新合成的 DNA 所取代。新合成的 DNA 存在切口，用 DNA 連接酶把這些切口連接在一起形成一條完整的 DNA 鏈。 RNase H 法優(yōu)于 S1 核酸酶法，它能獲得包括 mRNA 5' 端全部或絕大部分的更長(zhǎng)順序 cDNA 分子。 3） 將 cDNA 重組到載體上 合成的 cDNA 與載體 DNA 進(jìn)行連接一般有 3 種方法：① 借助于末端轉(zhuǎn)移酶的 3' -OH 端合成均聚物的能力，雙鏈 cDNA 和線性化載體 DNA 的 3' -OH 端分別加上均聚核苷酸鏈；② 雙鏈 cDNA 和線性化載體 DNA 分別用 Klenow 片段進(jìn)行末端補(bǔ)平，然后用 T4 DNA 連接酶進(jìn)行齊頭連接，形成重組體；③ 通過(guò)粘性末端連接。 4）. 轉(zhuǎn)化：重組的載體 DNA 分子在一定條件下轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，形成攜帶質(zhì)粒的菌株。當(dāng)不同重組的 DNA 含有不同的 cDNA 基因時(shí)，整個(gè)轉(zhuǎn)化子含有來(lái)自 mRNA 群體的各種 cDNA 基因，這樣的轉(zhuǎn) 化子群體構(gòu)成該 mRNA 全部遺傳信息的 cDNA 基因文庫(kù)。 5）. 目的 cDNA 克隆的鑒定：用于從 cDNA 文庫(kù)中篩選和鑒定目的 cDNA 的方法主要有 3 種：① 核酸雜交 ②免疫學(xué)雜交檢測(cè) ③ cDNA 同胞選擇

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