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  可愛的好事 2016-09-07 00:00:00

  NF2基因突變造成Merlin蛋白缺失與失活，引起細(xì)胞失控性生長導(dǎo)致腫瘤形成。Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病主要表現(xiàn)為雙側(cè)前庭神經(jīng)許旺細(xì)胞瘤及多發(fā)腦膜瘤等。雙側(cè)前庭神經(jīng)許旺細(xì)胞瘤是其典型臨床特征，常表現(xiàn)為耳鳴、聽力損害、眩暈及平衡障礙，逐漸導(dǎo)致聽力下降乃至喪失，嚴(yán)重影響著患者的生存質(zhì)量及壽命。為探求Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病較為有效的ZL方法，從細(xì)胞水平對該病進(jìn)行靶向ZL、藥物篩查及NF2基因突變個體化研究顯得尤為重要。已有研究表明腫瘤性許旺細(xì)胞很可能是許旺細(xì)胞瘤的來源細(xì)胞。本研究擬通過Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病組織標(biāo)本提取并純化腫瘤性細(xì)胞，為進(jìn)一步研究改善Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病的醫(yī)學(xué)處理建立體外實驗平臺。 Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病患者約50%有明確的家族遺傳病史，其中50%由新發(fā)基因突變引起。NF2基因突變的形式多種，對該病在基因水平上進(jìn)行個體化研究，可更清楚地了解該病NF2基因突變的個體化差異及與表型的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)該病新的基因突變形式；通過患者及其子女的NF2基因?qū)Ρ?，對預(yù)測患者子女將來是否發(fā)病有重要意義。本研究擬建立臨床適用的Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病的分子遺傳分析方法，對Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病患者及其后代進(jìn)行分子遺傳診斷，以指導(dǎo)Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病家族的遺傳咨詢及個體化病情監(jiān)測、隨訪及臨床干預(yù)。 本課題研究分以下兩個部分： diyi部分：建立Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病腫瘤性許旺細(xì)胞體外提取并純化的方法，以獲取足夠數(shù)量及純度的細(xì)胞，提高原代培養(yǎng)的成功率。利用10例Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病患者術(shù)中收集的的新鮮許旺細(xì)胞瘤組織標(biāo)本為實驗材料，Ⅰ型膠原酶消化培養(yǎng)法提取腫瘤性許旺細(xì)胞，低濃度胰蛋白酶快速消化法、差數(shù)貼壁法和克隆篩選技術(shù)純化細(xì)胞。鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)，結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測S-100蛋白表達(dá)，鑒定經(jīng)體外培養(yǎng)純化的細(xì)胞為腫瘤性許旺細(xì)胞。結(jié)果顯示：10例腫瘤組織標(biāo)本中成功培養(yǎng)獲得腫瘤性許旺細(xì)胞者共5例。腫瘤性許旺細(xì)胞原代培養(yǎng)至第3天，見大量雙極梭形或三角形細(xì)胞；利用低濃度胰酶快速消化法和差數(shù)貼壁法純化細(xì)胞；培養(yǎng)至第3代，倒置相差顯微鏡下可見4～5個細(xì)胞克隆，免疫細(xì)胞化學(xué)染色S-100蛋白表達(dá)陽性，腫瘤性許旺細(xì)胞純度達(dá)>95%，活力良好，可以穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。 第二部分：建立臨床適用的Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病的分子遺傳分析方法，對Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病病人及其后代進(jìn)行分子遺傳診斷，以指導(dǎo)Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病家族的遺傳咨詢及個體化病情監(jiān)測、隨訪及臨床干預(yù)。對上述原代培養(yǎng)的腫瘤性許旺細(xì)胞及患者的血液進(jìn)行基因組DNA抽提；10例Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病患者中，2例已有后代并知情同意接受基因測序，同時對其后代的血液進(jìn)行基因組DNA提取；對親子二代血液及患者的腫瘤性許旺細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行NF2基因測序(E1-15及E17外顯子及其鄰近的內(nèi)含子)；根據(jù)病人的臨床表現(xiàn)及病征制定合理的臨床干預(yù)及隨訪計劃，結(jié)合親子二代分子遺傳檢測結(jié)果，對后代Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病罹患風(fēng)險高的人群給予遺傳咨詢，制定后代的隨訪計劃。本研究啟動建立了我科Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病腫瘤標(biāo)本庫與基因組DNA庫；基因測序結(jié)果顯示腫瘤性許旺細(xì)胞與患者血液提取的NF2基因突變位點相同；diyi組母女存在完全相同的基因突變位點，第二組母子基因突變位點不完全一致，檢測到的突變位點均位于靠近外顯子的調(diào)控區(qū)。 結(jié)論： 1.應(yīng)用體外原代培養(yǎng)方法結(jié)合低濃度酶快速消化法、差數(shù)貼壁法及克隆篩選，能夠有效剔除許旺細(xì)胞瘤組織中的纖維母細(xì)胞，獲得純度高、活力好的腫瘤性許旺細(xì)胞，可用于Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病發(fā)病及ZL研究。 2.建立Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病許旺細(xì)胞瘤組織標(biāo)本及基因組DNA庫為該病分子遺傳研究提供組織及基因組DNA資源；分子遺傳分析方法可以很好的指導(dǎo)該病的臨床工作，提前預(yù)計后代罹患風(fēng)險，對高風(fēng)險人群制定個體化的隨訪計劃，對該病做到早發(fā)現(xiàn)及早ZL；與病人建立長期隨訪計劃，給予其個體化的病情監(jiān)測及臨床干預(yù)，可以提高患者的生活質(zhì)量，延長生存期。

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  zky914 2016-09-17 00:00:00

  NF2基因突變造成Merlin蛋白缺失與失活，引起細(xì)胞失控性生長導(dǎo)致腫瘤形成。Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病主要表現(xiàn)為雙側(cè)前庭神經(jīng)許旺細(xì)胞瘤及多發(fā)腦膜瘤等。雙側(cè)前庭神經(jīng)許旺細(xì)胞瘤是其典型臨床特征，常表現(xiàn)為耳鳴、聽力損害、眩暈及平衡障礙，逐漸導(dǎo)致聽力下降乃至喪失，嚴(yán)重影響著患者的生存質(zhì)量及壽命。為探求Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病較為有效的ZL方法，從細(xì)胞水平對該病進(jìn)行靶向ZL、藥物篩查及NF2基因突變個體化研究顯得尤為重要。已有研究表明腫瘤性許旺細(xì)胞很可能是許旺細(xì)胞瘤的來源細(xì)胞。本研究擬通過Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病組織標(biāo)本提取并純化腫瘤性細(xì)胞，為進(jìn)一步研究改善Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病的醫(yī)學(xué)處理建立體外實驗平臺。 Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病患者約50%有明確的家族遺傳病史，其中50%由新發(fā)基因突變引起。NF2基因突變的形式多種，對該病在基因水平上進(jìn)行個體化研究，可更清楚地了解該病NF2基因突變的個體化差異及與表型的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)該病新的基因突變形式；通過患者及其子女的NF2基因?qū)Ρ龋瑢︻A(yù)測患者子女將來是否發(fā)病有重要意義。本研究擬建立臨床適用的Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病的分子遺傳分析方法，對Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病患者及其后代進(jìn)行分子遺傳診斷，以指導(dǎo)Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病家族的遺傳咨詢及個體化病情監(jiān)測、隨訪及臨床干預(yù)。 本課題研究分以下兩個部分： diyi部分：建立Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病腫瘤性許旺細(xì)胞體外提取并純化的方法，以獲取足夠數(shù)量及純度的細(xì)胞，提高原代培養(yǎng)的成功率。利用10例Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病患者術(shù)中收集的的新鮮許旺細(xì)胞瘤組織標(biāo)本為實驗材料，Ⅰ型膠原酶消化培養(yǎng)法提取腫瘤性許旺細(xì)胞，低濃度胰蛋白酶快速消化法、差數(shù)貼壁法和克隆篩選技術(shù)純化細(xì)胞。鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)，結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測S-100蛋白表達(dá)，鑒定經(jīng)體外培養(yǎng)純化的細(xì)胞為腫瘤性許旺細(xì)胞。結(jié)果顯示：10例腫瘤組織標(biāo)本中成功培養(yǎng)獲得腫瘤性許旺細(xì)胞者共5例。腫瘤性許旺細(xì)胞原代培養(yǎng)至第3天，見大量雙極梭形或三角形細(xì)胞；利用低濃度胰酶快速消化法和差數(shù)貼壁法純化細(xì)胞；培養(yǎng)至第3代，倒置相差顯微鏡下可見4～5個細(xì)胞克隆，免疫細(xì)胞化學(xué)染色S-100蛋白表達(dá)陽性，腫瘤性許旺細(xì)胞純度達(dá)>95%，活力良好，可以穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。 第二部分：建立臨床適用的Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病的分子遺傳分析方法，對Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病病人及其后代進(jìn)行分子遺傳診斷，以指導(dǎo)Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病家族的遺傳咨詢及個體化病情監(jiān)測、隨訪及臨床干預(yù)。對上述原代培養(yǎng)的腫瘤性許旺細(xì)胞及患者的血液進(jìn)行基因組DNA抽提；10例Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病患者中，2例已有后代并知情同意接受基因測序，同時對其后代的血液進(jìn)行基因組DNA提取；對親子二代血液及患者的腫瘤性許旺細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行NF2基因測序(E1-15及E17外顯子及其鄰近的內(nèi)含子)；根據(jù)病人的臨床表現(xiàn)及病征制定合理的臨床干預(yù)及隨訪計劃，結(jié)合親子二代分子遺傳檢測結(jié)果，對后代Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病罹患風(fēng)險高的人群給予遺傳咨詢，制定后代的隨訪計劃。本研究啟動建立了我科Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病腫瘤標(biāo)本庫與基因組DNA庫；基因測序結(jié)果顯示腫瘤性許旺細(xì)胞與患者血液提取的NF2基因突變位點相同；diyi組母女存在完全相同的基因突變位點，第二組母子基因突變位點不完全一致，檢測到的突變位點均位于靠近外顯子的調(diào)控區(qū)。 結(jié)論： 1.應(yīng)用體外原代培養(yǎng)方法結(jié)合低濃度酶快速消化法、差數(shù)貼壁法及克隆篩選，能夠有效剔除許旺細(xì)胞瘤組織中的纖維母細(xì)胞，獲得純度高、活力好的腫瘤性許旺細(xì)胞，可用于Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病發(fā)病及ZL研究。 2.建立Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病許旺細(xì)胞瘤組織標(biāo)本及基因組DNA庫為該病分子遺傳研究提供組織及基因組DNA資源；分子遺傳分析方法可以很好的指導(dǎo)該病的臨床工作，提前預(yù)計后代罹患風(fēng)險，對高風(fēng)險人群制定個體化的隨訪計劃，對該病做到早發(fā)現(xiàn)及早ZL；與病人建立長期隨訪計劃，給予其個體化的病情監(jiān)測及臨床干預(yù)，可以提高患者的生活質(zhì)量，延長生存期。

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