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  要書翠 2015-01-31 00:00:00

  PCR是DNA的體外擴增技術. DNA復制是有生命力的細胞在體內(nèi) 自我復制的過程 ，屬于體內(nèi)擴增. PCR(聚合酶鏈式反應)原理 PCR是體外酶促合成特異DNA片段的方法，主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個步驟反復的熱循環(huán)構成： 即在高溫（95℃）下，待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板；而后在低溫（37～55℃）情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結合，形成部分雙鏈；在Taq酶的Z適溫度（72℃）下，以引物3’端為合成的起點，以單核苷酸為原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新鏈。這樣，每一雙鏈的DNA模板，經(jīng)過一次解鏈、退火、延伸三個步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復進行，每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴增一倍，PCR產(chǎn)物得以2n的批數(shù)形式迅速擴增，經(jīng)過25～30個循環(huán)后，理論上可使基因擴增109倍以上，實際上一般可達106～107倍。

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  李子易y 2015-12-05 00:00:00

  PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR純化試劑盒純化后，可以做EcoRI和BamHI的雙酶切。酶切、純化都可以用PCR純化試劑盒完成，只有一種情況例外，PCR模板為質(zhì)粒，且這個質(zhì)粒和要用的載體有相同的抗性。此時需要跑一次膠來丟掉模板質(zhì)粒，否則在連接產(chǎn)物轉化的平板上長出的菌落許多是模板質(zhì)粒，而不是你所構建的質(zhì)粒。 PCR產(chǎn)物不經(jīng)純化也可以直接酶切，但也很麻煩，效果可能不會很好，可能需要添加其他東西（亞精胺，限制性內(nèi)切酶緩沖液，BSA等）來完成酶切。

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  ouyangting8829 2017-10-15 01:45:48

  PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR純化試劑盒純化后，可以做EcoRI和BamHI的雙酶切。酶切、純化都可以用PCR純化試劑盒完成，只有一種情況例外，PCR模板為質(zhì)粒，且這個質(zhì)粒和要用的載體有相同的抗性。此時需要跑一次膠來丟掉模板質(zhì)粒，否則在連接產(chǎn)物轉化的平板上長出的菌落許多是模板質(zhì)粒，而不是你所構建的質(zhì)粒。 PCR產(chǎn)物不經(jīng)純化也可以直接酶切，但也很麻煩，效果可能不會很好，可能需要添加其他東西（亞精胺，限制性內(nèi)切酶緩沖液，BSA等）來完成酶切。

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  hevdvjd 2017-09-28 14:31:54

  不可以。 首先，采用的是質(zhì)粒模板； 其次，擴增得到的非單一條帶，如果不純化直接酶切，那么得到的將是帶有相應酶切位點的幾種片段，繼續(xù)試驗的話，菌落PCR鑒定時可能會出現(xiàn)幾種不同大小的條帶。 第三、PCR產(chǎn)物里面緩沖液并不是合適的酶切緩沖液，會極大的影響酶切的效率。甚至于根本就切不開，即便是隔夜酶切也不可以。

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