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  hlzxh1979 2010-12-22 00:00:00

  用熒光素標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行分子雜交 在熒光顯微鏡下可以直接顯示出與探針雜交的核酸在染色體或者細(xì)胞中的位置

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  同意一下子哦 2016-12-01 00:00:00

  熒光原位雜交方法是一種物理圖譜繪制方法，使用熒光素標(biāo)記探針，以檢測探針和分裂中期的染色體或分裂間期的染色質(zhì)的雜交。 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization， FISH)是在20世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù)，以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法，探針首先與某種介導(dǎo)分子(reporter molecule)結(jié)合，雜交后再通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接上熒光染料.FISH的基本原理是將DNA(或RNA)探針用特殊的核苷酸分子標(biāo)記，然后將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上，再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異性結(jié)合來檢測DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對定量分析.FISH具有安全、快速、靈敏度高、探針能長期保存、能同時顯示多種顏色等優(yōu)點(diǎn)，不但能顯示中期分裂相，還能顯示于間期核.同時在熒光原位雜交基礎(chǔ)上又發(fā)展了多彩色熒光原位雜交技術(shù)和染色質(zhì)纖維熒光原位雜交技術(shù). 對于利用rRNA的熒光原位雜交來說，如下原因可導(dǎo)致較低的熒光信號強(qiáng)度： 較低的細(xì)胞核糖體含量 較低的細(xì)胞周邊的通透性 較低的目標(biāo)序列可接觸性（由于rRNA的折疊產(chǎn)生的構(gòu)象，有些位置與rRNA分子內(nèi)其他鏈或其他rRNA或蛋白緊密接觸，從而使探針無法和目標(biāo)序列雜交） 為檢驗(yàn)細(xì)胞中的目標(biāo)序列是否容易被探針雜交，及測試Z佳雜交溫度，可利用“克隆熒光原位雜交”(clone-FISH)進(jìn)行試驗(yàn)：將rRNA基因結(jié)合入質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中表達(dá)，構(gòu)成核糖體，再用熒光標(biāo)記的探針雜交。 FISH可與流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)用，對特定熒光標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)或者分離。 熒光原位雜交（FISH）技術(shù)簡介 1974年Evans首次將染色體顯帶技術(shù)和染色體原位雜交聯(lián)合應(yīng)用，提高了定位的準(zhǔn)確性。20世紀(jì)70年代后期人們開始探討熒光標(biāo)記的原位雜交，即FISH技術(shù)。1981年Harper成功地將單拷貝的DNA序列定位到G顯帶標(biāo)本上，標(biāo)志著染色體定位技術(shù)取得了重要進(jìn)展。20世紀(jì)90年代，隨著人類基因組計(jì)劃的進(jìn)行，由于繪制高分辨人類基因組圖譜的需要，F(xiàn)ISH技術(shù)得到了迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。 1．原理 FISH(fluorescence in situ hybridization)技術(shù)是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)。它的基本原理是:如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報(bào)告分子如生物素、，可利用該報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進(jìn)行定性、定量或相對定位分析。 2．實(shí)驗(yàn)流程 FISH樣本的制備→探針的制備→探針標(biāo)記→雜交→（染色體顯帶）→熒光顯微鏡檢測→結(jié)果分析。 3．特點(diǎn) 原位雜交的探針按標(biāo)記分子類型分為放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記。用同位素標(biāo)記的放射性探針優(yōu)勢在于對制備樣品的要求不高，可以通過延長曝光時間加強(qiáng)信號強(qiáng)度，故較靈敏。缺點(diǎn)是探針不穩(wěn)定、自顯影時間長、放射線的散射使得空間分辨率不高、及同位素操作較繁瑣等。采用熒光標(biāo)記系統(tǒng)則可克服這些不足，這就是FISH技術(shù)。FISH技術(shù)作為非放射性檢測體系，具有以下優(yōu)點(diǎn):1、熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì)、安全；2、探針穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用；3、實(shí)驗(yàn)周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準(zhǔn)確；4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當(dāng)；5、多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列；6、既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。 缺點(diǎn)：不能達(dá)到雜交，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時效率明顯下降。 4．應(yīng)用 該技術(shù)不但可用于已知基因或序列的染色體定位，而且也可用于未克隆基因或遺傳標(biāo)記及染色體畸變的研究。在基因定性、定量、整合、表達(dá)等方面的研究中頗具優(yōu)勢。 編輯本段熒光原位雜交技術(shù)的發(fā)展歷程 1 FISH 技術(shù)檢測位點(diǎn)數(shù)目及檢測目標(biāo)的發(fā)展 在FISH 技術(shù)基本確立之后，F(xiàn)ISH 不僅用于單基因或核酸檢測，F(xiàn)ISH 技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展擴(kuò)展到多色FISH 多基因位點(diǎn)同時檢測，從基因檢測發(fā)展到基因組、染色體、活細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNAs 原位檢測以及組織水平的核酸檢測，并且在今后的研究中還有可能應(yīng)用到整個生物體的檢測。早期的探針較大，是通過載體的增殖、缺口平移法、體外轉(zhuǎn)錄法和隨機(jī)引物DNA 合成法來制備以獲得特異性雜交克隆。然而大片斷的探針通常帶有重復(fù)序列造成高熒光背景，采用未標(biāo)記的核酸進(jìn)行預(yù)處理使其與非特異性位點(diǎn)結(jié)合用于YZ非特異性雜交可以克服上述問題，同時也使得研究者擴(kuò)大了檢測目標(biāo)，實(shí)現(xiàn)了整條染色體染色。在細(xì)胞遺傳學(xué)上FISH 技術(shù)在染色體分析方面也因此得到了顯著的提高。如通過比較基因組雜交（Comparativegenomic hybridization）用于檢測染色體區(qū)域的缺失和重復(fù)。大片段探針一旦和樣品非特異性結(jié)合就會形成一個信號，混淆染色體上基因的檢測，就需要剪切成小片段＜200核苷酸。現(xiàn)在檢測手段的提高以及檢測軟件的不斷發(fā)展使得FISH技術(shù)的檢測要求越來越低，靈敏度越來越高。精確的計(jì)算機(jī)圖片處理算法的不斷改進(jìn)形成了亞顯微水平的探針高分辨技術(shù)。隨著檢測目標(biāo)越來越小，F(xiàn)ISH技術(shù)已用于隱蔽的亞端粒核型基因重排和精確的染色體作圖及單拷貝mRNA的檢測。 FISH 檢測范圍的擴(kuò)大，使得FISH 技術(shù)的應(yīng)用在20 世紀(jì)90 年代急速增長。由FISH 技術(shù)應(yīng)用而形成的分支技術(shù)實(shí)現(xiàn)了越來越多的不同類型位點(diǎn)同時檢測。首先是采用不同的熒光素來檢測多位點(diǎn)，如雙色熒光用于檢測特異的核酸序列，每一條染色體、基因或者轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別由一種可以分辨的熒光信號來表示。之后是采用兩種色彩譯碼方案進(jìn)一步擴(kuò)大了FISH 應(yīng)用范圍。譯碼方案主要是針對色彩比例，即每一種顏色在總顏色中所占的比例來描繪多位點(diǎn)。前述的每一種方法，或是兩種方法的結(jié)合都已經(jīng)將可檢測位點(diǎn)多達(dá) 12 個。采用計(jì)算機(jī)翻譯的五色方案可同時檢測出人類所有染色體代表著FISH 技術(shù)多位點(diǎn)檢測的里程碑。盡管可以采用多種方法觀測到mRNAs，但是FISH 對整個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的原位分析似乎更有應(yīng)用前景。色彩譯碼技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對整個組織的檢測。 2 FISH 技術(shù)的定量分析階段 Pinkel 等（1986）首次將熒光圖像定量分析用于基本細(xì)胞遺傳檢測，采用雙色激發(fā)塊裝置照相機(jī)檢測熒光信號，而且定量分析技術(shù)很快用于了mRNA 檢測。熒光檢測的關(guān)鍵是信號的重現(xiàn)性、無規(guī)律性及背景的自發(fā)熒光。不僅不同的樣品之間熒光不同，而且同一載玻片上的材料或者同樣的細(xì)胞都有可能顯示出不均衡的熒光。目前已有多種方法用于消除一些組織中的自發(fā)熒光：如樣品制備過程中，采用的消除自發(fā)熒光試劑包括硼氫化鈉或者采用光照輻射進(jìn)行預(yù)處理以消除非特異性背景信號。這些消除自發(fā)熒光的方法并不完全有效，通常在進(jìn)行圖像分析時通過計(jì)算機(jī)算術(shù)除去自發(fā)熒光信號。熒光圖像的光譜數(shù)據(jù)包括真正的信號和許多雜噪，分別進(jìn)行分析并且通過單獨(dú)的光譜組分分析除掉雜噪數(shù)據(jù)。多色FISH 有自身的限制，包括不同的熒光強(qiáng)度和顏色重疊。但是通過計(jì)算機(jī)算法分析平衡了多色圖像，包括強(qiáng)度變化和自動糾正信號重疊。 FISH圖像自身的限制并沒有影響到自動破譯算法的發(fā)展。采用序列較大探針進(jìn)行DNA 位點(diǎn)檢測和多色熒光計(jì)數(shù)算法輔助病理學(xué)家實(shí)現(xiàn)了自動化分析。此外，檢測探針試劑盒和點(diǎn)計(jì)數(shù)方法的應(yīng)用為便捷的檢測結(jié)果提供了一個平臺。盡管多種方法已經(jīng)用于分析或優(yōu)化自動細(xì)胞檢測系統(tǒng)，人工的細(xì)胞病理檢測仍是可信度高的組織分析方法。然而，細(xì)胞制備、鑒別、固定介質(zhì)上細(xì)胞樣品計(jì)算機(jī)化檢測在未來的醫(yī)學(xué)診斷中的GX益性不容忽視，快速檢測細(xì)胞內(nèi)的分子信號只有通過計(jì)算機(jī)輔助方法進(jìn)行檢測?，F(xiàn)在，自動化檢測程序已經(jīng)擴(kuò)展到采用多基因轉(zhuǎn)錄模型檢測特異的DNA 簇和轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)以確定功能細(xì)胞的狀態(tài)。 3 FISH 技術(shù)檢測領(lǐng)域的發(fā)展 鑒于FISH 起始階段的發(fā)展主要是探針類型和檢測位點(diǎn)的擴(kuò)展，熒光檢測技術(shù)將來的發(fā)展可能包括檢測領(lǐng)域的擴(kuò)展。熒光圖像臨床診斷應(yīng)用需要在檢測體系上進(jìn)一步提高，如探針的結(jié)合，照相和分析的自動化，因此避免了不同操作間的誤差。樣品厚度是熒光顯微鏡檢測樣品類型的一個限制因素。近來的激光共聚焦顯微鏡和光學(xué)X射線斷層攝影技術(shù)要求樣品厚度達(dá)到1~2mm。一種改進(jìn)的光學(xué)投射X 顯微斷層攝影技術(shù)可以獲取到15mm 厚樣品的圖像擴(kuò)大了生物學(xué)和診斷樣品的檢測范圍。活細(xì)胞的RNAs FISH 技術(shù)檢測也有報(bào)道。既可以采用體內(nèi)釋放的熒光集團(tuán)也可以采用雜交后探針的熒光素進(jìn)行檢測。這兩種新方法都可以降低非特異性標(biāo)記探針存在時的高背景（如活細(xì)胞），可以用于追蹤mRNA 的合成和轉(zhuǎn)移途徑。這些方法較綠色熒光蛋白（Green fluorescence protein， GFP）更易于檢測不同靶分子。相對于GFP 活細(xì)胞原位雜交檢測，F(xiàn)ISH 易受到細(xì)胞內(nèi)合成探針的影響。FISH 需要進(jìn)一步的改進(jìn)以降低活體基因表達(dá)檢測時的干擾背景，避免細(xì)胞內(nèi)自身雜交物的干擾。其實(shí)完全可以不必考慮FISH 檢測和熒光檢測蛋白技術(shù)的差異，將FISH 技術(shù)和熒光蛋白技術(shù)結(jié)合起來可以同時檢測目的核酸和蛋白。 多光子顯微技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)一步擴(kuò)大了熒光圖像的應(yīng)用范圍。采用多光子顯微鏡，激光塊可以發(fā)射光子聚焦于顯微鏡兩到三次激發(fā)目的熒光素。采用近紅外激發(fā)光可以更深層次穿透生物樣品，比可見光對活體樣品造成的毒性低。這種新方法的應(yīng)用已將熒光圖像用于活體系統(tǒng)的檢測，甚至整個動物體。由于還不能合成生物體標(biāo)記探針，因此目前生物體內(nèi)熒光圖像的應(yīng)用只限于檢測熒光分子或生物體自發(fā)熒光。生物組織在正常的生理或者病理生理過程中產(chǎn)生的自發(fā)熒光信號可以作為一種重要的診斷信號。一旦生物體探針成為可能，將會成為鑒別特異核酸序列，進(jìn)行非入侵診斷，獲取診斷圖像的一種有力輔助手段。

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