通過血管網(wǎng)絡(luò)，腫瘤可以源源不斷地獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，并進(jìn)行增殖和轉(zhuǎn)移。貝伐珠單抗（Bev）作為一種GX的抗血管生成抗體，一方面能夠阻斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）并YZ腫瘤血管生成，另一方面能夠使血流正常化，降低組織間質(zhì)液壓力，從而使ZL藥物可以進(jìn)入腫瘤深處并均勻分布。

如何利用Bev的優(yōu)勢(shì)對(duì)腫瘤進(jìn)行有效治 療呢？

中 國(guó)藥科大學(xué)工學(xué)院黃德春教授和陳維教授團(tuán)隊(duì)在ACS期刊《Biomacromolecules》上發(fā)表了題為“Tumor-Adhesive and pH-Degradable Microgels by Microfluidics and Photo-Cross-Linking for Efficient Antiangiogenesis and Enhanced Cancer Chemotherapy”的文章并給出了解決方案。

該文章報(bào)道了經(jīng)多巴胺（DA）修飾的聚乙烯醇（PVA）微凝膠，這種微凝膠還“裝載”有Bev和多西紫杉醇（DTX），表示為——DMGs@Bev/DTX。DMGs@Bev/DTX對(duì)腫瘤的作用機(jī)理如下：

1） 對(duì)腫瘤組織具有粘附性的DA使得DMGs@Bev/DTX可以長(zhǎng)時(shí)間保留在腫瘤部位；

2） 對(duì)pH有響應(yīng)的PVA在腫瘤區(qū)域酸性條件下可以發(fā)生降解，并持續(xù)釋放出Bev和DTX；

3） Bev可以YZ腫瘤血管生成，進(jìn)而遏制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移；

4） DTX可以對(duì)腫瘤進(jìn)行化療，起到消滅腫瘤的效果。

其中，DMGs@Bev/DTX對(duì)于熒光素酶（Luc）基因標(biāo)記的4T1腫瘤模型小鼠的治LX果通過光學(xué)成像進(jìn)行了研究——Figure 4. C圖右下DMGs@Bev/DTX實(shí)驗(yàn)組，經(jīng)過10天的ZL后，腫瘤已基本消除——Luc生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)在VILBER多功能活體成像系統(tǒng)——Fusion FX7上完成。

VILBER Fusion FX7多功能成像系統(tǒng)

產(chǎn)品特點(diǎn)：

· 采用新一代深度制冷的CCD相機(jī)，暗電流0.0001e/p/s@-90℃, 制冷速度更快且壽命更長(zhǎng)；

· F0.7超級(jí)鏡頭，大大提高了單位時(shí)間內(nèi)的進(jìn)光量，從而有效縮短曝光時(shí)間，尤其適用于Luc報(bào)告基因檢測(cè)的生物發(fā)光成像；

· 熒光成像采用脈沖LED光源，7通道，激發(fā)強(qiáng)度比鹵素?zé)舾摺；趻呙璺绞?，激發(fā)均一性≥99%；

· 全自動(dòng)控制7位發(fā)射濾光片輪，搭載6個(gè)專用窄波濾光片，涵蓋400~900nm，滿足多種染料的檢測(cè)需求；

· 配備小鼠專用恒溫臺(tái)兼容小鼠麻醉系統(tǒng)，通量可達(dá)5只小鼠。

應(yīng)用范圍：

· 小動(dòng)物成像：基于生物發(fā)光或熒光的腫瘤發(fā)育、藥物代謝、細(xì)胞遷移追蹤、納米材料研究等；

· 植物成像：LUC 或GFP、RFP等報(bào)告基因檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因鑒定、基因互作、微生物侵染、植物發(fā)育、植物生物節(jié)律等；

· 化學(xué)發(fā)光 & 熒光Western blot，Northern blot或Southern blot；

· 免染膠，銀染&考染蛋白膠，SSCP膠，培養(yǎng)皿（細(xì)胞或菌落），微孔板，蛋白芯片或其他基于熒光或化學(xué)發(fā)光的樣品。

常規(guī)的組織學(xué)檢查通常使用冷凍或石蠟包埋的樣本切片，微米級(jí)別厚度的組織切片允許對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記及表征，但卻無(wú)法探知生物樣本的三維特性。切片分析只對(duì)病理樣本的局部進(jìn)行了探測(cè)研究，整個(gè)病理組織中，有相當(dāng)大部分的信息仍未被探索。隨著組織透明化技術(shù)的發(fā)展與光片顯微鏡的誕生，我們終于可以對(duì)完整樣本進(jìn)行完整的成像表征。最近發(fā)表在Nature Reviews Cancer的一篇綜述中[1]總結(jié)了組織透明化、成像技術(shù)及3D成像的新應(yīng)用等。

組織透明化方法在近十年內(nèi)迅速發(fā)展，各種化合物的聯(lián)合使用已被廣泛用于減少光散射和光吸收，并增加光學(xué)顯微鏡在成像中的成像深度。雖然組織透明化最初由神經(jīng)科學(xué)家用于描繪小鼠中shu和外周的神經(jīng)系統(tǒng)，而近幾年的研究表明，對(duì)于組織的三維成像也可助力發(fā)育生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)和腫瘤機(jī)理等多種學(xué)科。例如腫瘤研究中，三維熒光成像已被用于評(píng)估腫瘤遷移性、腫瘤組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞異質(zhì)性、表征腫瘤微環(huán)境和評(píng)估腫瘤模型的ZL反應(yīng)等。

作者首先對(duì)各種透明化方法的特點(diǎn)進(jìn)行了比較與介紹，腫瘤因其異質(zhì)性及致密的結(jié)構(gòu)首先需選擇適當(dāng)?shù)耐该骰绞?。接下?lái)，作者介紹了3D成像在腫瘤研究中的應(yīng)用：
1.成像并定量：2D成像無(wú)法避免因切片帶來(lái)的數(shù)據(jù)缺失，3D成像則可以很直接的進(jìn)行數(shù)據(jù)定量[2]；

2.腫瘤結(jié)構(gòu)：3D成像有助于從細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞骨架等腫瘤模型中進(jìn)行發(fā)生、發(fā)展分析[3]；

3.脈管系統(tǒng)：脈管系統(tǒng)與腫瘤進(jìn)展及侵襲性相關(guān)，3D成像有助于評(píng)估抗血管生成的ZL反應(yīng)[4]；

此外，對(duì)完整組織的3D成像也有助于對(duì)于腫瘤的轉(zhuǎn)移評(píng)估、深入探索腫瘤微環(huán)境；腫瘤侵襲、傳播與耐藥性相關(guān)的病理研究；3D組織病理學(xué)研究等。

 
參考文獻(xiàn)：[1] Almagro J, Messal HA, Zaw Thin M, van Rheenen J, Behrens A. Tissue clearing to examine tumour complexity in three dimensions. Nat Rev Cancer. 2021 Jul 30. doi: 10.1038/s41568-021-00382-w. Epub ahead of print. PMID: 34331034.[2] Wei M, Shi L, Shen Y, Zhao Z, Guzman A, Kaufman LJ, Wei L, Min W. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Apr 2;116(14):6608-6617. doi: 10.1073/pnas.1813044116. Epub 2019 Mar 14. PMID: 30872474; PMCID: PMC6452712.[3] Messal HA, Alt S, Ferreira RMM, Gribben C, Wang VM, Cotoi CG, Salbreux G, Behrens A. Tissue curvature and apicobasal mechanical tension imbalance instruct cancer morphogenesis. Nature. 2019 Feb;566(7742):126-130. doi: 10.1038/s41586-019-0891-2. Epub 2019 Jan 30. PMID: 30700911; PMCID: PMC7025886.[4] Dobosz M, Ntziachristos V, Scheuer W, Strobel S. Multispectral fluorescence ultramicroscopy: three-dimensional visualization and automatic quantification of tumor morphology, drug penetration, and antiangiogenic treatment response. Neoplasia. 2014 Jan;16(1):1-13. doi: 10.1593/neo.131848. PMID: 24563615; PMCID: PMC3924547.

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　　1、哪種細(xì)胞密度最適合我的實(shí)驗(yàn)？

　　通常，我們建議每孔使用5,000-10,000個(gè)HUVEC。 但是，確定最佳細(xì)胞數(shù)對(duì)于使用μ-Slide血管生成從管形成測(cè)定中獲得最佳結(jié)果是至關(guān)重要。 細(xì)胞密度取決于細(xì)胞類型和細(xì)胞大小。 因此，在開始實(shí)際實(shí)驗(yàn)之前，我們建議在非抑制條件下播種幾個(gè)細(xì)胞數(shù)并對(duì)管形成進(jìn)行成像。 然后，對(duì)于最佳測(cè)定條件，使用在您的實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生最多管數(shù)的細(xì)胞密度。請(qǐng)記住，細(xì)胞通常不會(huì)在凝膠基質(zhì)上增殖。請(qǐng)參閱：血管生成實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)裝置優(yōu)化和數(shù)據(jù)分析 |ibidi μ-Slide

　　2、應(yīng)該在哪個(gè)時(shí)間段內(nèi)觀察細(xì)胞？

　　管形成的持續(xù)時(shí)間取決于細(xì)胞類型和所使用的細(xì)胞外基質(zhì)，應(yīng)單獨(dú)確定。 通常，HUVEC在 2-4小時(shí)后已經(jīng)形成管。24小時(shí)后細(xì)胞開始發(fā)生凋亡，這導(dǎo)致從基質(zhì)中脫離和管破裂。請(qǐng)參閱：血管生成實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)裝置優(yōu)化和數(shù)據(jù)分析 |ibidi μ-Slide

　　3、是否需要活細(xì)胞成像裝置來(lái)每小時(shí)拍攝管形成測(cè)定的照片？

　　非必須，通過顯微鏡對(duì) μ-Slide 血管生成上的同一位置進(jìn)行一致和精確的成像。 可以使用顯示 x/y 坐標(biāo)的顯微鏡載物臺(tái)或自動(dòng)載物臺(tái)來(lái)完成成像。 使用自動(dòng)化平臺(tái)，可以將孔的所有位置（特別是每個(gè)孔的中心）保存到位置列表中，您可以在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)訪問相應(yīng)的位置。

　　但是，使用完整的活細(xì)胞成像設(shè)置在顯微鏡上建立生理?xiàng)l件要方便得多。使用ibidi Stage Top 孵育系統(tǒng)等活細(xì)胞孵育裝置有助于在成像過程中提供穩(wěn)定溫度和濕度條件，從而在體外可以直接進(jìn)行視頻拍攝。

　　4、是否可以使用 μ-Slide 血管生成在凝膠基質(zhì)內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞？

　　可以，μ-Slide 血管生成非常適合在精確定義的3D基質(zhì)中培養(yǎng)細(xì)胞。由于大界面的凝膠和頂部細(xì)胞培養(yǎng)基，凝膠中的條件可以通過更換上部?jī)?chǔ)液器中的介質(zhì)來(lái)調(diào)整。

　　5、應(yīng)該在管形成實(shí)驗(yàn)中使用含酚紅的凝膠還是不含酚紅的凝膠？

　　對(duì)于使用μ-Slide血管生成的管形成測(cè)定中的相差顯微鏡，酚紅不會(huì)干擾圖片，并且由于其顏色，處理更容易。然而，當(dāng)使用熒光顯微鏡時(shí)，酚紅可能會(huì)干擾探頭的波長(zhǎng)。在這種情況下，應(yīng)該使用無(wú)酚紅凝膠。

　　6、是否需要將μ-Slide Angiogenesis血管生成載玻片放入培養(yǎng)箱的濕室中進(jìn)行凝膠聚合？

　　我們建議將μ-Slide血管生成載玻片放入加濕腔中進(jìn)行凝膠聚合。 雖然反應(yīng)室對(duì)于聚合本身不是必需的，但它可以最大限度地減少蒸發(fā)的影響。 在高流量孵化器中，防止蒸發(fā)的足夠百分比的濕度可能不會(huì)始終保持一致。 μ-Slide血管生成中的少量凝膠會(huì)很快變干，這會(huì)導(dǎo)致彎液面的形成。

　　7、胎牛血清 (FBS) / 胎牛血清 (FCS) 濃度是否會(huì)影響管形成實(shí)驗(yàn)中的管形成和降解速率？

　　一般是的。 這取決于所使用的細(xì)胞類型或細(xì)胞系。 當(dāng)提供濃度高達(dá) 10% FCS 的細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)，我們?cè)?μ-Slide 血管生成中觀察到典型的原代細(xì)胞 (HUVEC) 管形成和 Matrigel? 上的幾種內(nèi)皮細(xì)胞系。 但是，我們建議分別優(yōu)化每個(gè)細(xì)胞系的 FBS/FCS 濃度。

　　8、您是否推薦使用減少生長(zhǎng)因子的 Matrigel? 進(jìn)行管形成分析？

　　對(duì)于使用μ-Slide血管生成的管形成測(cè)定，我們使用了減少生長(zhǎng)因子的 Matrigel? 和未減少的 Matrigel?。請(qǐng)參閱：腫瘤學(xué)必備 | 血管生成實(shí)驗(yàn)介紹

　　9、我們希望使用減少了生長(zhǎng)因子的 Matrigel? 和無(wú)血清培養(yǎng)基以及 50 ng/ml VEGF。 這足以刺激管的形成嗎？

　　可以，這種組合足以刺激ibidi血管生成實(shí)驗(yàn)室器皿中的管形成，而培養(yǎng)基中沒有任何額外的生長(zhǎng)因子。

　　10、除了 Matrigel? 之外，您在試管形成實(shí)驗(yàn)中是否有使用其他凝膠的經(jīng)驗(yàn)？

　　原則上，任何凝膠都可用于μ-Slide血管生成管形成實(shí)驗(yàn)。 細(xì)胞可以附著在表面上是很重要的。 膠原蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白為細(xì)胞粘附提供了重要的結(jié)合基序。

　　11、什么是管形成實(shí)驗(yàn)合適的陽(yáng)性和陰性對(duì)照？

　　建議使用陽(yáng)性和陰性對(duì)照來(lái)減少管形成實(shí)驗(yàn)中的變量。陽(yáng)性對(duì)照是預(yù)期細(xì)胞在其中形成血管的樣本（取決于實(shí)驗(yàn)設(shè)置），從而向研究人員表明該實(shí)驗(yàn)已正確進(jìn)行。陰性對(duì)照是與所有其他樣品以相同方式處理的樣品，但預(yù)計(jì)不會(huì)顯示任何實(shí)驗(yàn)結(jié)果（例如，很少或沒有管形成）。

　　ibidi血管生成實(shí)驗(yàn)室器皿中管形成實(shí)驗(yàn)的最佳陽(yáng)性和陰性對(duì)照很大程度上取決于所使用的細(xì)胞、凝膠基質(zhì)和一般實(shí)驗(yàn)設(shè)置。因此，我們建議您查閱文獻(xiàn)，了解您感興趣的主題中成功使用的對(duì)照（陽(yáng)性和陰性對(duì)照）。

　　在下文中，您可以找到管形成測(cè)定中陽(yáng)性和陰性對(duì)照的可能方法：

　　如果需要分析特定化合物誘導(dǎo)血管生成的效力，則可以使用用已知血管生成誘導(dǎo)劑（例如 VEGF 或 FGF2）處理的樣品作為陽(yáng)性對(duì)照。濃度很大程度上取決于細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)設(shè)置。

　　如果使用原代細(xì)胞，預(yù)篩選的內(nèi)皮細(xì)胞系（例如，HUVEC）在用特定生長(zhǎng)因子處理后表現(xiàn)出明確的反應(yīng)，可以作為陽(yáng)性對(duì)照。

　　對(duì)于某些細(xì)胞類型，形成管的能力還取決于所使用的凝膠基質(zhì)。作為陽(yáng)性對(duì)照，內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)在含有饑餓培養(yǎng)基（不含生長(zhǎng)因子或血清的培養(yǎng)基）的生長(zhǎng)因子減少的 Matrigel?上顯示管形成。如果需要測(cè)試促血管生成物質(zhì)，則使用饑餓培養(yǎng)基尤其重要，因?yàn)榇蠖鄶?shù)細(xì)胞培養(yǎng)基都添加了生長(zhǎng)因子。為了分析物質(zhì)的真實(shí)效果，基質(zhì)和培養(yǎng)基都必須不含任何生長(zhǎng)因子。作為陰性對(duì)照，細(xì)胞可以播種在不同的基質(zhì)（例如膠原蛋白 I）上，預(yù)計(jì)不會(huì)形成管狀。

　　不影響細(xì)胞活力的管形成抑制劑（例如，蘇拉明或蘿卜硫素）可用作陰性對(duì)照。如果實(shí)驗(yàn)的目的是測(cè)試抗血管生成物質(zhì)，則使用這種類型的抑制劑尤其重要。

　　如果用任何溶解的物質(zhì)（例如，在 DMSO 或乙醇中）處理細(xì)胞，則僅使用溶劑作為陰性對(duì)照。

　　12、是否有用于分析管形成實(shí)驗(yàn)的推薦染色方案？

　　一般來(lái)說，相差顯微鏡足以自動(dòng)分析 μ-Slide血管生成中的標(biāo)準(zhǔn)管形成實(shí)驗(yàn)。 但是，如果您想研究某種標(biāo)記，您可以應(yīng)用您的標(biāo)準(zhǔn)方案（例如，用于免疫熒光染色），但要小心，以免損壞凝膠基質(zhì)或細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。

　　使用calcein的染色方案示例可參閱：腫瘤學(xué)必備 | 血管生成實(shí)驗(yàn)介紹

　　13、在開始實(shí)驗(yàn)之前，我是否必須將 ibidi 血管生成實(shí)驗(yàn)室器皿平衡到 37°C？

　　不，不需要平衡 μ-Slide 血管生成。 在室溫下儲(chǔ)存，可以立即用凝膠基質(zhì)填充。 由于μ-Slide 的開孔形式，加熱時(shí)從凝膠中逸出的氣體可以與大氣自由交換。

　　14、完成實(shí)驗(yàn)后，μ-Slide Angiogenesis和μ-Plate Angiogenesis 96 Well可以重復(fù)使用嗎？

　　不可以，μ-Slide血管生成載玻片和μ-Plate血管生成96孔板是一次性耗材，僅供一次性使用。

　　15、μ-Slide 血管生成是否有96孔版的？

　　有。 μ-Plate血管生成96孔板具有與μ-Slide血管生成相同的“孔中孔”設(shè)計(jì)和凝膠體積 (10 μl)。 μ-Plate血管生成96孔可用作高通量管形成實(shí)驗(yàn)的篩選板，具有完全的ANSI/SLAS (SBS) 和robotics兼容性。

近日，浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院楊根生教授團(tuán)隊(duì)吳丹君老師等人在ACS（美國(guó)化學(xué)會(huì)）期刊《Applied Materials & Interfaces》上發(fā)表題為A Near-Infrared Laser-Triggered Size-Shrinkable Nanosystem with In Situ Drug Release for Deep Tumor Penetration文章。

本文報(bào)道了一種初始粒徑為101 nm的可收縮納米復(fù)合材料——這種材料到達(dá)腫瘤區(qū)域后，在近紅外（NIR）激光照射下發(fā)生解離，釋放出化療藥物DOX并進(jìn)入腫瘤內(nèi)部。該納米復(fù)合材料由嵌段共聚物封裝金納米棒與DOX而形成。在近紅外激光照射腫瘤部位時(shí)，金納米棒可以將光能轉(zhuǎn)化為熱能，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤淺表組織的光熱消融；與此同時(shí)，嵌段共聚物分解為一個(gè)個(gè)超小的膠粒（~7 nm），這些超小膠粒進(jìn)入腫瘤內(nèi)部后，在原位釋放出DOX，以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的光熱-化療藥物聯(lián)合治 療。

其中，納米復(fù)合材料在小鼠體內(nèi)的生物分布通過熒光成像進(jìn)行了研究，熒光成像實(shí)驗(yàn)在多功能活體成像系統(tǒng)——VILBER Fusion FX7上完成。

VILBER Fusion FX7多功能成像系統(tǒng)

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· 熒光成像采用脈沖LED光源，7通道，激發(fā)強(qiáng)度比鹵素?zé)舾?。基于掃描方式，激發(fā)均一性≥99%；

· 全自動(dòng)控制7位發(fā)射濾光片輪，搭載6個(gè)專用窄波濾光片，涵蓋400~900nm，滿足多種染料的檢測(cè)需求；

· 配備小鼠專用恒溫臺(tái)兼容小鼠麻醉系統(tǒng)，通量可達(dá)5只小鼠。

應(yīng)用范圍：

·小動(dòng)物成像：基于生物發(fā)光或熒光的腫瘤發(fā)育、藥物代謝、細(xì)胞遷移追蹤、納米材料研究等；

· 植物成像：LUC 或GFP、RFP等報(bào)告基因檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因鑒定、基因互作、微生物侵染、植物發(fā)育、植物生物節(jié)律等；

· 化學(xué)發(fā)光 & 熒光Western blot，Northern blot或Southern blot；

· 免染膠，銀染&考染蛋白膠，SSCP膠，培養(yǎng)皿（細(xì)胞或菌落），微孔板，蛋白芯片或其他基于熒光或化學(xué)發(fā)光的樣品。

細(xì)胞因子是腫瘤微環(huán)境（Tumor Microenvironment,TME）中細(xì)胞通訊的關(guān)鍵介質(zhì)，在癌癥的發(fā)生、發(fā)展、治 療和預(yù)后等多個(gè)方面發(fā)揮重要作用。在過去的 40 年中，細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體作為癌癥靶點(diǎn)或癌癥治 療方法得到了廣泛的研究。目前公認(rèn)的臨床前治 療策略為增強(qiáng)干擾素和白細(xì)胞介素（包括 IL-2 ，IL-7 ，IL-12 和 IL-15 ）的生長(zhǎng)抑 制和免疫刺激作用，或抑 制細(xì)胞因子（如 TNF ，IL-1β 和 IL-6 ）的炎癥和促進(jìn)腫瘤的作用[1]。

圖 1 . 細(xì)胞因子在腫瘤微環(huán)境中的作用

特定細(xì)胞因子的表達(dá)也與腫瘤細(xì)胞的高存活率和高轉(zhuǎn)移性密切相關(guān)。其中促炎細(xì)胞因子 IL-6 和 IL-8 與多種癌癥相關(guān)，包括淋巴瘤、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸直腸癌等 [2,3]。因此，分析細(xì)胞因子的表達(dá)是一種重要的診斷工具和預(yù)測(cè)癌癥預(yù)后的關(guān)鍵因素。

非放射性的 RNA 原位雜交技術(shù)（ViewRNA ISH）是一種高靈敏度的檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)的有效方法，并且可以對(duì) 1 至 4 個(gè) mRNA 目標(biāo)進(jìn)行多重分析。

檢測(cè)原理如下圖所示：

圖 2 .  ViewRNA ISH 檢測(cè)原理

安捷倫BioTek Cytation 5 多功能細(xì)胞成像微孔板檢測(cè)系統(tǒng)，可容納多達(dá)四個(gè)熒光通道同時(shí)成像，快速并出色地成多色熒光成像。儀器配備的高內(nèi)涵分析軟件可自動(dòng)計(jì)算細(xì)胞內(nèi) RNA 的表達(dá)水平。Cytation 5 活細(xì)胞成像工作站結(jié)合ViewRNA ISH，為細(xì)胞因子研究提供了一種高效率、高靈敏度和可重復(fù)的檢測(cè)方法。

實(shí)驗(yàn)案例分享

 實(shí)驗(yàn)一．細(xì)胞因子mRNA的成像和分析 

為研究細(xì)胞因子mRNA 在不同營(yíng)養(yǎng)條件下的表達(dá)情況，設(shè)置兩組對(duì)照實(shí)驗(yàn)。陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基中，而陰性對(duì)照細(xì)胞經(jīng)過 18 小時(shí)的血清饑餓處理。隨后加入 ViewRNA 探針以標(biāo)記 IL-6 、IL-8 和 ACTB mRNA ，在Cytation 5 上分別使用 RFP 、GFP 、Cy5 和 DAPI 通道對(duì)探針進(jìn)行成像完成 ISH 細(xì)胞分析。圖像結(jié)果表明：細(xì)胞因子mRNA 的表達(dá)在營(yíng)養(yǎng)匱乏的條件下會(huì)顯著降低。

圖 3 . 陽(yáng)性和陰性對(duì)照組成像。HCT116 放大 20 倍圖像作為（ A ）陽(yáng)性對(duì)照和（ B ）陰性對(duì)照。MDA-MB-231 細(xì)胞放大 40 倍的圖像作為（ C ）陽(yáng)性對(duì)照和（ D ）陰性對(duì)照。藍(lán)色：DAPI 染色的細(xì)胞核；綠色：標(biāo)記 IL-8 mRNA ；橙色：標(biāo)記 IL-6 mRNA ；紅色：標(biāo)記 ACTB mRNA 。

接下來(lái)為了定量分析細(xì)胞因子表達(dá)，首先在 Cytation 5 的 DAPI 通道下進(jìn)行細(xì)胞核計(jì)數(shù)，以確定每孔的細(xì)胞數(shù)量（圖 4A ）。然后分別在GFP 、RFP 通道進(jìn)行細(xì)胞因子探針（ IL-6 或 IL-8 ）的熒光信號(hào)分析（圖 4B ）。通過細(xì)胞熒光信號(hào)的比率評(píng)估不同實(shí)驗(yàn)條件下的細(xì)胞因子表達(dá)（圖 5 ）。

圖 4 . 每個(gè)細(xì)胞的熒光信號(hào)分析。( A ) 使用 Agilent-BioTek Gen5 軟件進(jìn)行細(xì)胞分析圈選出 DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核；( B ) 熒光標(biāo)記的 IL-8 信號(hào)的圖像分析。

如圖 5 所示，使用 ViewRNA ISH 和 Cytation 5 這一組合準(zhǔn)確的量化了細(xì)胞內(nèi) IL-6 和 IL-8 mRNA 的表達(dá)。

圖 5 . MDA-MB-231 細(xì)胞中 IL-8 表達(dá)和 HCT116 細(xì)胞中 IL-6 表達(dá)，并以細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行校正。

 實(shí)驗(yàn)二．誘導(dǎo)細(xì)胞因子 mRNA 的表達(dá) 

使用不同劑量的 IL-1β 刺激 DU145 細(xì)胞，以分析細(xì)胞因子的 mRNA 的表達(dá)（圖6）。圖 7 結(jié)果顯示：雖然 IL-6 和 IL-8 的 mRNA 表達(dá)增加，但 IL-8 的表達(dá)變化更為顯著，這與先前研究結(jié)果一致[4]。IL-1β 的最 高劑量下，這兩種細(xì)胞因子的表達(dá)減少則是由于細(xì)胞毒性。這驗(yàn)證了該檢測(cè)方法的可行性與穩(wěn)定性。

圖 6 . 不同濃度的 IL-1β 刺激下的 IL-6 、IL-8 和 ACTB 熒光 mRNA 探針信號(hào) ( A ) 0 ng/mL；( B ) 0.02 ng/mL ；0.128 ng/mL；( D ) 0.8 ng/mL。藍(lán)色：DAPI染色的細(xì)胞核；綠色：標(biāo)記的IL-8 mRNA；橙色：標(biāo)記的 IL-6 mRNA ；紅色：標(biāo)記的 ACTB mRNA 。

圖 7 . 不同濃度的 IL-1β 刺激下 DU145 細(xì)胞中 IL-6 和 IL-8 mRNA 的表達(dá)。

 實(shí)驗(yàn)三．抑 制細(xì)胞因子 mRNA 的表達(dá) 

研究表明絲裂原活化蛋白激酶（ MAPK ）可調(diào)節(jié) IL-8 ，并證明用 MAPK/ERK 抑 制劑 U 0126 治 療可減少 DU145 和 MDA-MB-231 細(xì)胞中的炎癥細(xì)胞因子[4,5]。為了確認(rèn)這一現(xiàn)象并驗(yàn)證 ViewRNA ISH 和 Cytation 5 這一組合的能力，將不同濃度的 U 0126 加入到每種細(xì)胞類型中孵育 30 分鐘。然后用 1 ng/mL 的 IL-1β 刺激 DU145 細(xì)胞達(dá) 3 小時(shí)，而 MDA-MB-231 細(xì)胞未被刺激。使用 GFP 和 RFP 通道進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和圖像分析以評(píng)估在 U 0126 治 療后 IL-8 和 IL-6 細(xì)胞因子 mRNA 的表達(dá)。采集的圖像（圖 8 ）和計(jì)算的熒光信號(hào)強(qiáng)度 （圖 9 ）證實(shí)了 U 0126 的抑 制作用。此外，也驗(yàn)證了該方法的靈敏度，可以準(zhǔn)確識(shí)別給予抑 制劑后 mRNA 的表達(dá)變化。

圖 8. U 0126 抑 制 IL-8 mRNA 的表達(dá)。圖像顯示了在不同濃度的 U 0126 處理后 ( A-E ) MDA-MB-231 細(xì)胞內(nèi) IL-6 、IL-8 和 ACTB 熒光 mRNA 探針信號(hào)；( F-J ) 為 DU145 細(xì)胞。藍(lán)色：DAPI 染色的細(xì)胞核；綠色：標(biāo)記的 IL-8 mRNA ；橙色：標(biāo)記的 IL-6 mRNA ；紅色：標(biāo)記的 ACTB mRNA 。

圖 9 . U 0126 治療后 IL-8 和 IL-6 mRNA 在 MDA-MB-231 和 DU 145 細(xì)胞中的表達(dá)

結(jié) 語(yǔ)

ThermoFisher 的 ViewRNA ISH 細(xì)胞分析試劑盒和探針提供一種靈敏的方法來(lái)檢測(cè) mRNA 表達(dá)。該方法在安捷倫BioTek Cytation 5 細(xì)胞成像系統(tǒng)的加持下得以更更快地采集多熒光通道的圖像，并更精 準(zhǔn)的計(jì)算出每一個(gè)細(xì)胞的熒光信號(hào)強(qiáng)度。這種檢測(cè)、成像和分析的完 美結(jié)合提供了一種靈敏、靈活和高通量的方法用以檢測(cè)細(xì)胞因子 mRNA 的表達(dá)。

參考文獻(xiàn)：

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Ocean HR2光纖光譜儀憑借其專有的CCD陣列探測(cè)器和低雜散光光學(xué)平臺(tái)設(shè)計(jì)，為從等離子體監(jiān)測(cè)到藥物分析等各種應(yīng)用提供了優(yōu)異的光譜性能。本次測(cè)試，將聚焦海洋光學(xué)HR2光纖光譜儀的吸光度線性度以及高分辨率性能。

關(guān)于Ocean HR2

海洋光學(xué)Ocean HR2高分辨率光纖光譜儀結(jié)構(gòu)緊湊，堅(jiān)固耐用，積分時(shí)間快至1μs，熱波長(zhǎng)穩(wěn)定性——漂移小于每攝氏度0.06個(gè)像素，可在溫度變化時(shí)保證可靠的光譜性能。它涵蓋 ~190-1150 nm 內(nèi)各種波長(zhǎng)范圍，可選狹縫尺寸，以幫助用戶控制光通量和光學(xué)分辨率。

Ocean HR2光譜儀可與海洋光學(xué)光源、附件和軟件兼容，允許用戶針對(duì)不同的應(yīng)用優(yōu)化。此外，每臺(tái)HR2海洋光學(xué)光譜儀都配有Ocean Direct，這是個(gè)功能強(qiáng)大的跨平臺(tái)軟件開發(fā)工具包，帶有應(yīng)用程序編程接口。

吸光度測(cè)量：重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品

為測(cè)試海洋光學(xué)HR2光纖光譜儀的吸光度線性度，測(cè)量了重鉻酸鉀吸光度標(biāo)準(zhǔn)品，每種樣品的濃度水平都不同。

測(cè)量吸光度實(shí)驗(yàn)包括海洋光學(xué)HR2-UV-VIS光譜儀、帶衰減器的DH-2000氘燈光源、兩根400 μm光纖，石英比色皿、Square One比色皿支架和海洋光譜儀軟件OceanView。

圖1.重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸光度

（濃度范圍20.27-100.95 mg/L）

圖1為使用Ocean HR2測(cè)得的紫外吸收譜，可看出Ocean HR2出色的低雜散光性能，特別是當(dāng)繪制與濃度關(guān)系時(shí)，其吸光度線性度為0.9997（圖2）。

圖2.高吸光度線性度是海洋光學(xué)光譜儀HR2的一個(gè)特點(diǎn)。

藍(lán)色線為重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)量結(jié)果，基于該標(biāo)準(zhǔn)曲線，可預(yù)測(cè)該波長(zhǎng)范圍內(nèi)1.5 AU以下幾乎任何樣品的濃度。

吸光度測(cè)量：牛血清白蛋白BSA

BSA常用作生化應(yīng)用中的蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)品。下面使用與重鉻酸鉀實(shí)驗(yàn)相同的Ocean HR2光譜儀配置，在蒸餾水中測(cè)量了質(zhì)量同為503mg的30種不同濃度的BSA。

為確保獲得更佳測(cè)量結(jié)果，建議在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意以下：

測(cè)量前，將光譜儀和光源預(yù)熱30分鐘。預(yù)熱有助于光源達(dá)到熱平衡狀態(tài)，避免由于光源輸出的微小變化而導(dǎo)致的測(cè)量偏差。

采樣時(shí)避免取下石英比色皿，因?yàn)檫@樣做可能會(huì)引入錯(cuò)誤。正確的做法是，在比色皿中進(jìn)行溶液稀釋，使用一次性移液管吸取每個(gè)樣品的一部分，然后在去離子水中混合，并對(duì)每個(gè)樣品重復(fù)該過程。

同時(shí)，還建議避免測(cè)量中移動(dòng)光纖。

圖3. BSA樣品在 279 nm 處有強(qiáng)烈的吸收峰。

使用BSA測(cè)量的吸光度線性度結(jié)果甚至比重鉻酸鉀更好。取279 nm處的吸收峰（圖3），吸光度直至2.5AU，也能保證吸光度線線性度0.999（圖4）。這種性能使Ocean HR2成為定量其他類型的蛋白質(zhì)濃度及生物應(yīng)用，如分析血液成分和對(duì)藥物配方進(jìn)行質(zhì)量保證的理想選擇。

圖4. 近30個(gè)BSA樣品上測(cè)得的吸光度線性度高達(dá)0.999。

高分辨率的Ocean HR2：識(shí)別譜線

由于光學(xué)平臺(tái)優(yōu)化設(shè)計(jì)，HR2海洋光學(xué)光譜儀的分辨率（FWHM）通常小于1nm。例如在測(cè)量汞氬燈氣體放射光源時(shí)，在UV-VIS波段觀察到很多明確的尖峰（圖5）。

圖5.根據(jù)配置，可使用海洋光學(xué)光譜儀Ocean HR2實(shí)現(xiàn)亞納米級(jí)光學(xué)分辨率。

在測(cè)太陽(yáng)輻照度時(shí)觀察到類似的光學(xué)分辨率性能，25μm狹縫的Ocean HR2在其光譜范圍內(nèi)檢測(cè)到光學(xué)分辨率小于1.2nm的光譜發(fā)射線（圖6）。

采樣配置包括一個(gè)連接到600μm VIS-NIR光纖的余弦校正器，該光纖被放置在反射探頭支架中，并以90°對(duì)著天空。

圖6. HR2海洋光學(xué)光譜儀在太陽(yáng)輻照度測(cè)量中展示了其多功能性。

結(jié)語(yǔ)

從檢測(cè)等離子體和氣體中的窄發(fā)射線到確定蛋白質(zhì)的濃度，Ocean HR2 光纖光譜儀在實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)線上提供科研級(jí)光譜儀性能，能夠勝任研究或系統(tǒng)集成的苛刻要求。

西安某公司專業(yè)從事傳感器的研發(fā)和銷售，近期咨詢安泰測(cè)試，主要用于壓力傳感器抽檢及異常分析，希望我們能給他推薦一套合適的方案。技術(shù)在詳細(xì)了解了客戶的需求后，客戶帶著樣品來(lái)了安泰測(cè)試，技術(shù)馬工為客戶進(jìn)行了現(xiàn)場(chǎng)演示：

一、推薦儀器：

是德科技六位臺(tái)式萬(wàn)用表34461A

吉時(shí)利直流電源2220-30-1

二、用途：壓力傳感器抽檢及異常分析

三、被測(cè)對(duì)象：壓力傳感器輸出電信號(hào)

四、測(cè)試步驟：

1、電源sense端分別和輸出近端短接，輸出引線連接被測(cè)傳感器；

2、用直流電源給壓力傳感器供電，設(shè)置電壓5V，限流1mA；

3、根據(jù)規(guī)格書，大氣壓下傳感器工作輸出反饋電壓閾值在mV左右，根據(jù)電壓判定傳感器是否工作正常；

4、讀數(shù)與分析。

通過現(xiàn)場(chǎng)演示，是德科技六位臺(tái)式萬(wàn)用表34461A和吉時(shí)利直流電源2220-30-1能夠完全滿足客戶的需求，而且預(yù)算也在客戶范圍內(nèi)，客戶當(dāng)場(chǎng)決定購(gòu)買這2臺(tái)儀器。

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