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  294818965 2017-11-03 00:00:00

  首先，衰老的腫瘤細(xì)胞盡管不能增殖，但它們?nèi)员Ａ糁x活力，可產(chǎn)生具有YZ和促進(jìn)腫瘤生長活性的蛋白質(zhì)，能夠以旁分泌的形式影響鄰近腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤生長。其次，衰老細(xì)胞往往具有凋亡抗性，能夠通過過度表達(dá)Bcl一2而抵抗凋亡，故不容易清除而在人體長期存活。 腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，首先癌細(xì)胞是比較容易培養(yǎng)的細(xì)胞。當(dāng)前建立的細(xì)胞系中癌細(xì)胞系是Z多的。另外腫瘤對人類是威脅Z大的疾病。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是研究癌變機(jī)理、藥檢測、癌分子生物學(xué)極其重要的手段。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)對闡明和解決癌癥將起著不可估量的作用。 一、組織培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性 腫瘤細(xì)胞與體內(nèi)正常細(xì)胞相比，不論在體內(nèi)或在體外，在形態(tài)、生長增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。生長在體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞和在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，其差異較小，但也并非完全相同。培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞具以下突出特點(diǎn)： （－）形態(tài)和性狀 培養(yǎng)中癌細(xì)胞無光學(xué)顯微鏡下特異形態(tài)，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞鏡下觀察比二倍體細(xì)胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細(xì)胞表面的微絨毛多而細(xì)密，微絲走行不如正常細(xì)胞規(guī)則，可能與腫瘤細(xì)胞具有不定向運(yùn)動和錨著不依賴性有關(guān)。 （二）生長增殖 腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)具有不受控增殖性，在體外培養(yǎng)中仍如此。正常二倍體細(xì)胞在體外培養(yǎng)中不加血清不能增殖，是因血清中含有很細(xì)胞增殖生長的因子，而癌細(xì)胞在低血清中（2％～5％）仍能生長。已證明腫瘤細(xì)胞有自泌或內(nèi)泌性產(chǎn)生促增殖因子能力。正常細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后，出現(xiàn)能在低血清培養(yǎng)基中生長的現(xiàn)象，已成為檢測細(xì)胞惡變的一個(gè)指標(biāo)。癌細(xì)胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，形成集落（克隆）的能力比正常細(xì)胞強(qiáng)。另外癌細(xì)胞增殖數(shù)量增多擴(kuò)展時(shí)，接觸YZ消除，細(xì)胞能相互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物。 （三）永生性 永生性也稱不死性。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細(xì)胞可無限傳代而不凋亡（Apoptosis）。體外培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株都表現(xiàn)有這種性狀，體內(nèi)腫瘤細(xì)胞是否如此尚無直接證明。因惡性腫瘤終將殺死宿主并同歸于盡，從而難以證明這一性狀的存在。體外腫癌細(xì)胞的永生性是否能反證它在體內(nèi)時(shí)同樣如此？也尚難肯定。從近年建立細(xì)胞系或株的過程說明，如果永生性是體內(nèi)腫瘤細(xì)胞所固有的，腫瘤細(xì)胞應(yīng)易于培養(yǎng)。事實(shí)上，多數(shù)腫瘤細(xì)胞初代培養(yǎng)時(shí)并不那么容易。生長增殖并不旺盛；經(jīng)過純化成單一化瘤細(xì)胞后，也大多增殖若干代后，便出現(xiàn)類似二倍體細(xì)胞培養(yǎng)中的停滯期。過此階段后才獲得永生性，順利傳代生長下去。從而說明體外腫瘤細(xì)胞的永生性有可能是體外培養(yǎng)后獲得的。從一些具有永生性而無惡性性的細(xì)胞系，如NIH3T3、Rat－1、10T1/2等細(xì)胞證明，永生性和惡性（包括浸潤性）是兩種性狀，受不同基因調(diào)控，但卻有相關(guān)性?？赡苡郎允羌?xì)胞惡變的階段。至少在體外是如此。 （四）浸潤性 浸潤性是腫瘤細(xì)胞擴(kuò)張性增殖行為，培養(yǎng)癌細(xì)胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養(yǎng)時(shí)，能浸潤入其它組織細(xì)胞中，并有穿透人工隔膜生長的能力。 （五）異質(zhì)性 所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態(tài)等性狀不同的細(xì)胞組成。異質(zhì)性構(gòu)成同一腫瘤內(nèi)細(xì)胞的活力有差別的瘤組織；處于瘤體周邊區(qū)的細(xì)胞獲得血液供應(yīng)多，增殖旺盛，ZX區(qū)有的細(xì)胞衰老退化，有的處于周期阻滯狀態(tài)，那些呈活躍增殖狀態(tài)的細(xì)胞稱干細(xì)胞（Stem Cells）、只有這些干細(xì)胞才是支持腫瘤生長的成分。腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)易于生長增殖；把干細(xì)胞分離出來的培養(yǎng)方法稱干細(xì)胞培養(yǎng)。 （六）細(xì)胞遺傳 大多數(shù)腫瘤細(xì)胞有遺傳學(xué)改變，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細(xì)胞群常由多個(gè)細(xì)胞群組成，有干細(xì)胞系和數(shù)個(gè)亞系，并不斷進(jìn)行著適應(yīng)性演變。 （七）其它 腫瘤細(xì)胞在體外不易生長的原因可能由于：①依賴性：腫瘤細(xì)胞雖有較強(qiáng)克隆生長力，但仍有一定的群體性或與其它細(xì)胞相依存關(guān)系。一是腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互依存，二是腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)成纖維細(xì)胞的依賴。體外分散培養(yǎng)和排除成纖維細(xì)胞后也會同時(shí)消除或減弱這些依存關(guān)系，可能影響癌細(xì)胞增殖生長的活性；②腫瘤細(xì)胞的自泌也會因分散培養(yǎng)而被稀釋，達(dá)不到腫瘤生長的需求，降低腫瘤細(xì)胞的生長增殖力；③并非所有腫瘤細(xì)胞都有強(qiáng)的生長活力和長的Life Span，只有干細(xì)胞才有強(qiáng)的增殖生長能力，但這些細(xì)胞數(shù)量很少；④離體培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞可能需求與體內(nèi)相似的特殊生存條件。 二、培養(yǎng)方法 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細(xì)胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個(gè)方面。在具體培養(yǎng)方法方面，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與正常組織細(xì)胞培養(yǎng)并無原則差別，初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。 （一）要點(diǎn) 1．取材： 人腫瘤細(xì)胞來自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū)，取材時(shí)盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。取材后宜盡快進(jìn)行培養(yǎng)，如因故不能立即培養(yǎng)，可貯存于4℃中，但不宜栽過24小時(shí)。 2．培養(yǎng)基： 腫瘤細(xì)胞對培養(yǎng)基的要求不如正常細(xì)胞嚴(yán)格，一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞對血清的需求比正常細(xì)胞低，正常細(xì)胞培養(yǎng)不加血清不能生長，腫瘤細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長。腫瘤細(xì)胞對培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性較大，是因腫瘤細(xì)胞有自泌（Autocrine）性產(chǎn)生促生長物質(zhì)之故。但這并不說明腫瘤細(xì)胞完全不需要這些成分。按不同細(xì)胞需要不同的生長因子；腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間、腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間對生長因子的需求都存在著差異。但大多數(shù)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中仍需要生長因子。有的還需特異性生長因子〔如乳腺癌細(xì)胞等）?？傊囵B(yǎng)腫瘤細(xì)胞仍需加血清和相關(guān)生長因子培養(yǎng)更易成功。 3．成纖維細(xì)胞的排除： 成纖維細(xì)胞常與腫瘤細(xì)胞同時(shí)混雜生長，致難以純化腫瘤細(xì)胞。而且成纖維細(xì)胞常比腫瘤細(xì)胞生長得快，Z終能壓制腫瘤細(xì)胞的生長。因此排除成纖維細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵。排除成纖維細(xì)胞有多種方法（表2－1）。 （二）成纖維細(xì)胞排除法 1．機(jī)械刮除法： 是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）。刮除程序?yàn)椋?（1）標(biāo)記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長腫瘤細(xì)胞的部位； （2）刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標(biāo)記空間； （3）用Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細(xì)胞； （4）注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留，可重復(fù)刮除至完全除掉為止 2．反復(fù)貼壁法： 根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點(diǎn)，并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液，把含有兩類細(xì)胞的細(xì)胞懸液反復(fù)貼壁，使兩類細(xì)胞相互分離，操作方法與傳代相同。 （1）待細(xì)胞生長達(dá)一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后，Hanks 沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液； （2）取編號為此A、B、C三個(gè)培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng)5～20分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入B培養(yǎng)瓶中后；向A瓶中補(bǔ)充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)； （4）培養(yǎng)B瓶中細(xì)胞5～20分鐘后，接處理A的方法，把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中；再向B瓶中補(bǔ)加完全培養(yǎng)基。 當(dāng)三個(gè)瓶內(nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見A瓶主要為成纖維細(xì)胞，B瓶兩類細(xì)胞相雜，C瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時(shí)可反復(fù)處理多次，直至癌細(xì)胞純化為止。 3．消化排除法： 此法曾用于乳癌細(xì)胞的培養(yǎng)，具體程序是： （1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時(shí)搖動培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細(xì)胞脫落下來后，便立即停止消化； （2）把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)；向原瓶內(nèi)也補(bǔ)加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用此法處理后，成纖維細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞易先脫落。經(jīng)過幾次反復(fù)處理，可能把成纖維細(xì)胞除凈。 4．膠原酶消化法： 本法是利用成纖維細(xì)胞對膠原酶較為敏感的特點(diǎn)，通過消化進(jìn)行選擇。 （1）可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后，即終止消化； （2）用Hanks洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細(xì)胞。如成纖維細(xì)胞未被除凈，可再次重復(fù)。 5．其它方法： 有人發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺有YZ成纖維細(xì)胞生長的作用；也有人用聚蔗糖制備成比重1.025～1.085的密度梯度離心液，加入細(xì)胞懸液后，在23℃中800g離心 10分種。在比重1.025～1.050層為成纖維細(xì)胞，在比重1.050～1.085層為上皮細(xì)胞，再經(jīng)過分離進(jìn)行培養(yǎng)。Z近也有人應(yīng)用特殊化學(xué)物如SODYZ成纖維細(xì)胞生長的方法。 選用上述任何一種方法，都需進(jìn)行試驗(yàn)，取得必要經(jīng)驗(yàn)，找出適合的條件，才能獲得好的效果。 （三）提高腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)存活率和生長率措施 根據(jù)人們的經(jīng)驗(yàn)，腫瘤細(xì)胞在體外不易培養(yǎng)，建立能傳代的腫瘤細(xì)胞系更為困難。當(dāng)腫瘤組織或細(xì)胞初代接種培養(yǎng)后，常出現(xiàn)以下幾種情況： 完全無細(xì)胞游出或移動； 有細(xì)胞移動和游出，但無細(xì)胞增殖，細(xì)胞長時(shí)間處于停滯狀態(tài)以致難以傳代； 有細(xì)胞增殖，傳若干代后停止生長或衰退死亡； 傳數(shù)代后細(xì)胞增殖緩慢，經(jīng)過一段停滯期后，才又呈旺盛生長狀態(tài)，形成穩(wěn)定生長的腫瘤傳代細(xì)胞系。 以上現(xiàn)象說明腫瘤細(xì)胞對體外生存條件有較高的要求，并需經(jīng)過對新環(huán)境的適應(yīng)才能生長，因此欲獲得好的培養(yǎng)效果，不能局限于一般培養(yǎng)法，必須采用一些特殊的措施。 1．適宜底物： 把經(jīng)過純化的細(xì)胞接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層、飼細(xì)胞層等。 2．生長因子： 應(yīng)用促細(xì)胞生長因子，向培養(yǎng)液中增加一種或幾種促細(xì)胞生長因子。根據(jù)細(xì)胞種類不同選用不同的促生長物，常用有胰島素、氫化可的松、雌激素以及其它生長因子。 為提高腫瘤細(xì)胞對體外培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)力和增加有活力癌細(xì)胞（干細(xì)胞）的數(shù)量，可采用動物體轉(zhuǎn)嫁接種成瘤后，再從動物體內(nèi)取出進(jìn)行培養(yǎng)，能提高體外培養(yǎng)的成功率。受體動物以裸鼠Z好。 3.動物體媒介培養(yǎng)方法： （1）瘤塊接種：取新鮮瘤組織，用Hanks液洗凈血污，切成1～3毫米小塊，用穿刺針頭吸一小瘤塊，用酒精棉球擦拭動物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤塊； （2）飼養(yǎng)觀察，待腫瘤生長達(dá)較大體積后，剝?nèi)〕隽鼋M織； （3）進(jìn)行體外培養(yǎng)。 （4）為防止失敗，仍取部分瘤組織繼續(xù)在裸鼠體內(nèi)傳代。通過裸鼠媒介接種，有活力的腫瘤細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞培養(yǎng)易于成功。 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)方法與培養(yǎng)正常細(xì)胞完全相同，但成功率比正常細(xì)胞高。 （四）體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)檢測 一旦培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生長成形態(tài)上單一的細(xì)胞群體或細(xì)胞系（或株）后，不論用于實(shí)驗(yàn)研究還是建立細(xì)胞系，都需要做一系列的細(xì)胞生物學(xué)測定，主要的目的在于求得證明： 所培養(yǎng)的細(xì)胞系的確來源于原體內(nèi)具有惡性的細(xì)胞，而非正常細(xì)胞或其它細(xì)胞。均具有瘤種特異性。闡明一般生物學(xué)性狀。測定項(xiàng)目數(shù)量無明確規(guī)定，根據(jù)需要而定，以下為常做的項(xiàng)目和要點(diǎn)。 【形態(tài)觀察】主要觀察細(xì)胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例、染色質(zhì)和核仁大小、多少等以及細(xì)胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等。 【細(xì)胞生長增殖】檢測細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞分裂指數(shù)、倍增時(shí)間、細(xì)胞周期時(shí)間。 【細(xì)胞核型分析】檢測核型特點(diǎn)，染色體數(shù)量、標(biāo)記染色體的有無、帶型等。 【凝集試驗(yàn)】檢測凝集力。 【軟瓊脂培養(yǎng)】檢測集落形成能力。 【異體動物接種】向異體動物體內(nèi)（皮下）接種細(xì)胞懸液，觀察成瘤能力。 【其它】除上述項(xiàng)目外，根據(jù)需要還可做同位素標(biāo)記、組織化學(xué)成分分析，熒光顯微鏡觀察等。 在上述腫瘤細(xì)胞生物學(xué)檢測中，Z主要的為：異體動物（以用裸鼠為上）接種成瘤、軟瓊脂培養(yǎng)、核型分析、細(xì)胞骨架和電鏡觀察等幾項(xiàng)。當(dāng)然從分子細(xì)胞學(xué)角度考慮尚應(yīng)做癌基因和基因等的檢測，這些項(xiàng)目將在本書第二篇中介紹。 （五）對腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株的評價(jià) 已建成的各種腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株，無疑都是可用的實(shí)驗(yàn)對象。近年我國已建成的腫瘤細(xì)胞系已非常多，并獲得越來越廣泛的應(yīng)用。但根據(jù)研究者的經(jīng)驗(yàn)，在使用這些細(xì)胞系時(shí)，應(yīng)持特別審慎態(tài)度，主要是應(yīng)考慮到這些細(xì)胞在長期傳代中有否發(fā)生遺傳性改變的可能。眾所周知，長期傳代細(xì)胞系染色體核型常是不穩(wěn)定的。另外也可能發(fā)生如基因突變、基因易位或缺失等變化。其結(jié)果可能導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)性狀上的變動。以近年建成的各種腫瘤細(xì)胞系為例，都已傳代少則幾十，多則百代以上后，才確認(rèn)建成了細(xì)胞系。這種情況下很難保證細(xì)胞從初代到建成時(shí)的性狀仍是一致的。已如前述，癌細(xì)胞在培養(yǎng)中并非能很順利地傳下去，凡已長期傳代的細(xì)胞系，都已獲得不死性。當(dāng)前尚未完全確證所有癌細(xì)胞都具有不死性；因此尚難肯定在長期培養(yǎng)中的癌細(xì)胞的生物學(xué)性狀與體內(nèi)時(shí)仍完全相同（包括不死性）。據(jù)上述對用癌細(xì)胞系所獲實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)盡量做分析性的結(jié)論，避免做概括性的與體內(nèi)等同的結(jié)論，外推與體內(nèi)等同更是不妥的。廣泛來說，應(yīng)用各種較長時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)時(shí)，都應(yīng)如此。

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