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  cuichaoqun92 2011-11-16 00:00:00

  1、經(jīng)典的半定量RT-PCR和實(shí)時熒光定量RT-PCR。提取總RNA，通過光度計和電泳法檢測質(zhì)量并定量，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。對于半定量RT-PCR，采用內(nèi)標(biāo)基因（如25SRNA）引物對各樣品進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增和電泳，證明反轉(zhuǎn)錄成功，并通過調(diào)整加入的總cDNAdiyi鏈的量，使各樣品間內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增條帶亮度達(dá)到一致。然后以此總cDNAdiyi鏈的模板量進(jìn)行目標(biāo)基因的普通PCR擴(kuò)增，電泳后通過條帶有無和亮度強(qiáng)弱來比較各樣品間（器官組織間、發(fā)育階段間、誘導(dǎo)時間間等）目標(biāo)基因表達(dá)的水平的差異性或變化動態(tài)。對于實(shí)時熒光定量RT-PCR，反轉(zhuǎn)錄完成后，通過內(nèi)標(biāo)基因或其它基因的擴(kuò)增證明反轉(zhuǎn)錄成功，然后直接對內(nèi)標(biāo)基因和目標(biāo)基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，通過儀器自動檢測Ct值來比較各樣品間目標(biāo)基因表達(dá)水平的差異性或動態(tài)變化。 2、芯片雜交法和SAGE法。將各樣品的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的總cDNA進(jìn)一步合成為雙鏈總cDNA，用適當(dāng)?shù)拿盖刑幚?，得到小片段，然后與芯片雜交，電腦對不同樣品間相同基因的雜交信號強(qiáng)度進(jìn)行疊加處理，自動分析出各樣品間各基因表達(dá)水平的表達(dá)差異性或變化動態(tài)。SAGE (serial analysis of gene expression)是基因表達(dá)系列分析，將各樣品總cDNA采用適當(dāng)酶切，得到短片段，然后互相連接成800bp左右的串聯(lián)體，然后測序，然后采用電腦自動統(tǒng)計各基因被測序到的次數(shù)，以此表示各樣品內(nèi)各基因表達(dá)的豐度，然后比較各樣品間各基因表達(dá)水平的差異性或動態(tài)變化。

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